基因工程重組蛋白的分離純化放映-文庫吧資料
2024-09-05 09:26本頁面
【正文】 率低和過程效率低的問題 是蛋白質(zhì)產(chǎn)品分離純化的主流技術(shù)之一 連續(xù)逆流操作層析 基于液液分配機(jī)理 ， 可采用專門的逆流層析裝置 。 該方法具有使蛋白質(zhì)變性 、 僅適合部分蛋白質(zhì)等缺點(diǎn) 疏水作用層析多用于大分子蛋白質(zhì)的分離純化 其他方法 反相高效液相色譜法 一種以疏水作用為基礎(chǔ)的色譜分離法 具有分辨率高 、 重復(fù)性好 、 回收率高等優(yōu)點(diǎn) 操作繁瑣 、 難放大 、 成本高 ， 在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制 分子印跡 一種識(shí)別聚合物特殊結(jié)合位點(diǎn)的技術(shù) ， 是將生物大分子從凝膠轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)的過程 。 獲得分離的蛋白質(zhì)，均可用電洗脫或電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上直接進(jìn)行序列分析 基于對(duì)配體親和力差異的分離技術(shù) 親和層析 親和層析是一種以樣品的生物活性為依據(jù)的分離技術(shù)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液通過層析柱時(shí) ， 其中可與親和載體配基相互作用的受體被吸附劑結(jié)合 ，不被吸附的無關(guān)成分則可隨流出液通過柱體 ，從而將吸附蛋白與其他蛋白質(zhì)分開 ， 而后利用高濃度的底物溶液或親和力更強(qiáng)的底物衍生溶液洗脫目標(biāo)蛋白 ， 即可脫離層析柱上的載體 只需要一步處理即可使某種待分離的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白 質(zhì)混合物中分離出來 ,達(dá)到千倍以上的純化 , 并 保 持 較 高 的 活 性 如果目的蛋白作為藥品 ， 處理后的產(chǎn)品中存在微量染料或金屬都會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害 親和層析技術(shù)是基于蛋白質(zhì)可與另一種稱做配體的分子能發(fā)生特異的可逆結(jié)合 基于選擇性吸附差異的分離方法 疏水層析 利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動(dòng)相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合的特性進(jìn)行分離 。 無論是單向凝膠電泳還是雙向凝膠電泳，分離度都是極高的。 鹽溶和鹽析主要是通過影響蛋白質(zhì)分子表面的電荷而分離 、 純化蛋白質(zhì) 鹽析法是粗分離蛋白質(zhì)的重要方法之一，常用硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽。 反膠團(tuán)萃取法還可提取蛋白質(zhì)、酶、核酸、氨基酸和多肽。該技術(shù)現(xiàn)已成功地應(yīng)用于分離蛋白質(zhì)、抗生素微生物離子、電泳分離氨基酸等 采用雙水相系統(tǒng)濃縮目的蛋白，受聚合物分子量及濃度、溶液 pH、離子強(qiáng)度、鹽類型及濃度的影響 雙水相萃取技術(shù)是一種新型的分離技術(shù) 反膠團(tuán)萃取 指膠團(tuán)內(nèi)可溶解少量水而形成微型水池，利用膠團(tuán)對(duì)外界有機(jī)溶劑的屏蔽作用，實(shí)現(xiàn)生物物質(zhì)的溶解和分離 具有選擇性高、萃取過程簡單，正萃、反萃同時(shí)進(jìn)行，能有效防止大分子失活、變性 普通離子型表面活性劑可能對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)生污染 。 總體來說，蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。丁醇在一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶提取中更加優(yōu)越，溶解脂的能力強(qiáng)，兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會(huì)引起酶的變性失活。 為了沉淀目的蛋白 ， 把溶液的 pH調(diào)到目的蛋白的等電點(diǎn)即可 溶劑法 溶劑提取法包括水溶液提取法和有機(jī)溶劑提取法，其中緩沖溶液對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度大、穩(wěn)定性好，最為常用 。 必須利用不同型號(hào)透析袋，通用性不好 根據(jù)目的蛋白的分子大小來選 擇透析袋的型號(hào) 。 ? 凝膠過濾色譜 五 .幾種主要蛋白質(zhì)分離純化的方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比 方法 原理 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 特點(diǎn) 基于分子大小差異的分離技術(shù) 凝膠層析（又稱凝膠過濾、分子篩層析或排阻層析） 利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子大小差異分離混合物的方法。 ? 層析純化方法設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)目的蛋白和雜蛋白的物理、化學(xué)和生物學(xué)方面性質(zhì)的差異，尤其重要的是表面性質(zhì)差異，例如表面電荷密度、對(duì)一些配基的生物學(xué)特異性、表面疏水性、表面金屬離子、糖含量、自由疏基數(shù)目、分子大小和形狀 (相對(duì)分子質(zhì)量 )， pl，和穩(wěn)定性等。 層析純化 ? 預(yù)處理的產(chǎn)物可能仍與大量的雜質(zhì)混合在一起，這類雜質(zhì)可能有病毒、熱原質(zhì)、氧化產(chǎn)物、核酸、多聚體、雜蛋白、與目的物類似的異構(gòu)體等。 分離細(xì)胞碎片 分離細(xì)胞碎片是比較困難的，可以用離心、膜過濾或雙水相分配的方法，使細(xì)胞碎片分配在一相 (通常為下相 )而分離，同時(shí)也起部分純化作用； 得到的上清液可以通過硫酸氨分級(jí)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀、超濾濃縮脫鹽等進(jìn)行預(yù)處理，有些可以進(jìn)行特殊處理，如加熱、三氯乙酸處理等除去雜蛋白。利用酶溶法處理細(xì)
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