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重組蛋白和多肽的分離純化-文庫吧資料

2025-06-25 05:15本頁面
  

【正文】 ++++親和層析基于蛋白質(zhì)和親和配體的特異性相互作用,是最為高效的分離純化方法,用于親和層析的配體可以是針對抗原的抗體、針對蛋白質(zhì)分子的受體、酶的底物或抑制劑、針對糖分子的凝集素、活性染料、金屬離子、天然或改造過的相互作用多肽等等。傳統(tǒng)的片狀羥基磷灰石物理和化學穩(wěn)定性比較差,僅能在 低流速條件下使用,新的球形羥基磷灰石克服了以上缺點,對于其它方法不易分離的蛋白質(zhì),可以用羥基磷灰石層析進行分離純化。疏水層析的選擇性依賴于疏水配體的結(jié)構(gòu),有烷基配體和芳香基配體,烷基的鏈越長,蛋白質(zhì)的保留就越強。離子交換層析基于蛋白質(zhì)與離子交換介質(zhì)電荷間的相互作用,高于蛋白質(zhì)等電點,蛋白質(zhì)帶負電荷,低于蛋白質(zhì)等電點蛋白質(zhì)帶 正電荷,不同的蛋白質(zhì)在一定的pH條 件下與介質(zhì)上的離子之間相互作用不同,而產(chǎn)生不同的選擇性,根據(jù)帶電基團的類型和強度可分為四種類型:強陰離子交換層析、弱陰離子交換層析、強陽離子交換 層析、弱陽離子交換層析,通常采用一定的平衡條件使目標蛋白選擇性的吸附在介質(zhì)上,也可以使雜蛋白吸附,而目標蛋白選擇性的穿過。在 重組蛋白的分離純化中,各種分離模式都得到應(yīng)用。層析技術(shù)的另一個發(fā)展方向是功能基團的發(fā)展,適應(yīng)不同的選擇性要求,如各種不同 親和層析介質(zhì)的合成,使一步純化就能達到很高的純度。由于蛋白質(zhì)大分子具有高的親水性,要求分離介質(zhì)具有親水的界面,為活性大分子提供適宜的微環(huán)境,早期的離子交換介質(zhì)不具有親水的特性和大的孔結(jié)構(gòu),僅用于小分子的分離純化,Peterson 和 Sober 等在離子交換介質(zhì)的研究上進行了開拓性的工作,選擇特定的纖維素作為離子交換基團的基質(zhì),合成的離子交換纖維素介質(zhì)具有高的結(jié)合容量和低的不可逆性吸附,并得到實際應(yīng)用(89,90)。 層析技術(shù)在分離純化中的應(yīng)用層析技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離純化開始于60年代,現(xiàn)在已成為蛋白質(zhì)分離純化的高分辨的方法。膜分離技術(shù)和沉淀分離技術(shù)是兩種傳統(tǒng)的技術(shù),不管在實驗室研究,還是在工業(yè)的生產(chǎn)上都有 應(yīng)用,近年來功能性膜的應(yīng)用和膜色譜的發(fā)展大大擴展了膜分離的應(yīng)用領(lǐng)域,而親和技術(shù)和沉淀分離相結(jié)合產(chǎn)生了親和沉淀技術(shù),提高了分離的特異性。在膜蛋白的整個分離純化過程中,都要使用表面活性劑來模擬脂質(zhì)的功能,但膠束與蛋白質(zhì)的相互作用 常常降低層析的分辨率,而且聚集的情況更容易發(fā)生,所以在特定的純化階段選擇哪一種表面活性劑,以及使用多大的濃度,對分離純化的影響最為關(guān)鍵(88)。對于表達于細胞膜的蛋白質(zhì),先要破碎細胞后分離細胞膜,再抽提溶液進行膜蛋白的提取,由于膜蛋白具有疏水區(qū)域,在抽提溶液中需要加入表面活性劑,一方面破壞細胞膜,溶解膜結(jié)構(gòu),另一方面促進膜蛋白的溶解和穩(wěn)定,常用Triton X100、 脫氧膽酸鈉、Brij等弱的表面活性劑來保留蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。對于分泌到周質(zhì)間隙的蛋白質(zhì),使用滲透壓沖擊,凍融法,溶菌酶處理方法可以使目標蛋白釋放。大部分的可溶性重組 蛋白在細胞質(zhì)中表達,而一些膜蛋白常常表達于細胞內(nèi)膜上,還有一些則分泌到細菌的周質(zhì)間隙或細胞外。重 組蛋白在大腸桿菌中得到表達以后,首先必須從細菌釋放才能進行下游的分離純化過程。在單鏈抗體Fv段的透析復性中,加入固定化的氧化還原酶DsbA和DsbC可以顯著提高折疊的效率,得到的單鏈抗體Fv段和天然抗體Fv段具有相同的功能(46)。分子伴侶和折疊酶在體外有兩個方面的應(yīng)用,其一是在溶液中加入伴侶分子和/或折疊酶促進包涵體蛋白質(zhì)的折疊和裝配(39),另一方面就是通過固定化的伴侶分子和/或折疊酶來介導蛋白質(zhì)的折疊復性。酮戊二酸載體蛋白是線粒體內(nèi)膜上的一種轉(zhuǎn)運蛋白, C41(DE3)作為宿主菌使C端帶有組氨酸標簽的目標蛋白形成包涵體獲得大量表達,再用鎳柱親和色譜進行復性和純化,獲得的融合蛋白具有和天然蛋白一樣的轉(zhuǎn)運活性,每升的細菌培養(yǎng)液可獲得15mg的活性蛋白(50)。Zahn等在鎳親和層析柱(NiNTA argrose)上通過鹽酸胍/谷胱甘肽梯度進行帶有組氨酸標簽的人朊病毒蛋白多肽片段的氧化再折疊,抑制了蛋白質(zhì)聚集和分子間二硫鍵的形成,再用咪唑緩沖液對目標蛋白進行洗脫,純化的流程圖如圖4所示(20)。多肽通過在N端或C端加上一個親和標簽,在包涵體的純化上有兩個方面的用途,其一是包涵體變性溶解后,利用親和色譜直接進行包涵體溶液的純化,再用稀釋或透析的方法進行復性(55,57,60,64,65,68),其二就是用于親和色譜復性(61,66,67,69,70)。由于蛋白質(zhì)結(jié)合在固相介質(zhì)上,減少了折疊過程中由于分子間相互作用所造成的聚集,所以這一方法可提高折疊的效率。另外應(yīng)用連續(xù)環(huán)形色譜,蛋白樣品連續(xù)上樣于旋轉(zhuǎn)的色譜柱上,在提高折疊效率的同時,也提高了色譜復性處理的能力(29,30)。通過尿素線性梯度復性,變性溶菌酶以 高蛋白濃度上樣(17mg/ml)可以獲得90%的活性回收率,與稀釋復性和非梯度凝膠過濾復性相比較,顯著的改善了活性回收率(27)。通常選擇線性的梯度用于折疊復性,對于不同的蛋白質(zhì)還有其它的模式,如一些蛋白在特定的變性劑濃度范圍里不穩(wěn)定,在此變性 劑濃度范圍里就需要快速降低變性劑濃度。ller等用雙順反子表達載體同時表達等摩爾的A鏈和B鏈,但以包涵體的形式存在,為了得到活性的異源二聚體PDGFAB,包涵體用鹽酸胍變性后,先在變性條件下用凝膠過濾層析進行純化,使用稀釋復性,蛋白質(zhì)嚴重聚集,即使在10μg/ml蛋白質(zhì)濃度條件下,也只能得到45%可溶性蛋白,而用凝膠過濾復性,同時洗脫的A亞基和B亞基可以緩慢二聚化產(chǎn)生異源二聚體,,最終異源二聚體得率可達75%(26)。A. 凝膠過濾色譜復性凝膠過濾復性時,變性蛋白質(zhì)加樣于折疊緩沖液平衡好的凝膠過濾柱上,然后用折疊緩沖液進行洗脫,凝膠過濾層析有不同的分子量分級范圍,有助于聚集蛋白質(zhì)和正確折疊蛋白質(zhì)的分離。在折疊中,吸附的位點會影響到折疊,所以要優(yōu)化折疊的條件,才能得到好的折疊效果。復性折疊中存在的一個問題就是蛋白質(zhì)的聚集,為了減少導致蛋白質(zhì)聚集的分子間相互作用,可將蛋白質(zhì)結(jié)合在分離介質(zhì)上,達 到溶液中變性劑濃度的稀釋和蛋白質(zhì)的折疊,這一類型的復性為吸附型色譜復性,包括親和色譜復性,疏水相互作用色譜復性,離子交換色譜復性。色譜復性的方法的優(yōu)點是可以顯著的減少處理的時間,減少變復性過程中分 子的聚集,使復性的同時也達到了純化的效果。溶解復性獲得的蛋白質(zhì),需要通過離心和過濾的方法去除 不溶性的物質(zhì),再按可溶性蛋白質(zhì)的處理方法進行下游的分離純化。Arora等將這一方法用于人γ干擾素的復性,產(chǎn)品的得率和比活比文獻報道的都要高(72)。這個研究小組用相同的方法進行白介素12包涵體的折疊復性,僅加入氧化型谷胱甘肽而沒有還原型谷胱甘肽只有約57%的折疊效率,當兩者同時加入后則可達到90%(42),這些結(jié)果表明前一種蛋白比較容易形成正確的二硫鍵,而白介素12折疊復性需要加入還原型的谷胱甘肽促進二硫鍵重組,使蛋白質(zhì)最終選擇天然的二硫鍵,并促進折疊。在胰凝乳蛋白酶原的折疊復性中, M或高于3 M都會造成大量的沉淀, M濃度時有一半的蛋白質(zhì)沒有正確折疊,而在1 M時則完全折疊,說明折疊時的變性劑并不是越低越好,而是存在一個最佳濃度(13)。變性劑濃度的降低也可以分階段的進行,或先經(jīng)過稀釋,再透析去除剩余的變性劑,由于變性劑的濃度在開始時先降到一定的水平,增加了部分折疊中間體的溶解性,常??梢蕴岣哒郫B的效率,但是必須通過實驗選擇在不同階段使用的變性劑濃度,避開圖2 所示的c區(qū)段。對于折疊,是一個一級的反應(yīng)過程,而聚集是一個高級的反應(yīng)過程,依賴蛋白質(zhì)的濃度,所以 需要小心的選擇蛋白質(zhì)的濃度,一般的蛋白質(zhì)的終濃度保持在2050μg/mL。為了很快避開低溶解性變性劑區(qū)(如圖2中c區(qū) 段所示),減少蛋白的聚集,在進行稀釋時一定要快速。此外,在前胰島素的折疊復性中也應(yīng)用了磺酸化保護(44,47,48),所以這一方法在進行復雜蛋白的變復性時可以采用。人組織纖溶酶原激活劑(tPA)含有35個半胱氨酸殘基,可形成17對二硫鍵,即使在天然狀態(tài)下也只具有低的溶解性,進行原核表達時這兩種巰基保護方法都被用于該蛋白質(zhì)的折疊復性,由于在蛋白質(zhì)的巰基上引入了帶電荷的殘基,增加了變性蛋白和部分折疊中間體的溶解性,減少了復性過程中蛋白質(zhì)的聚集,可獲得較高的復性效率(25,32,33)。常用的方法有:1 使用金屬催化的空氣氧化,并添加還原劑促進二硫鍵改組,由于氧在蛋白質(zhì)溶液中溶解性低,這種方法的效率較低,改用攪拌促進氧的質(zhì)量傳輸,又會造成蛋白質(zhì)的聚集;2 使用小分子還原型和氧化型的巰基試劑對,包括還原型和氧化型的谷胱甘肽(GSH/GSSG)、半胱氨酸和胱氨酸(cysteine/cystine)、半胱胺和胱胺(cysteamine/cystamine)、二硫蘇糖醇和氧化型谷胱甘肽(DTT/GSSG),二流赤蘚糖醇和氧化型谷胱甘肽(DTE/GSSG),這一方法是目前常用的方法,通常使用的巰基試劑總濃度為515mM,還原劑和氧化劑的比為5:1―1:1(4,74)。另一種方法就是加入添加劑來減少聚集,促進折疊,如L精氨酸,鹽,有機溶劑,一些表面活性劑,滲透壓調(diào)節(jié)劑(osmolytes),硫代甜菜堿類物質(zhì)(NDSBs),這些物質(zhì)或穩(wěn)定蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象,或使部分折疊的中間體不穩(wěn)定,表2 列出了這些化合物和它們可能的作用機制,它們在蛋白質(zhì)的折疊中起著重要的作用,已得到廣泛的應(yīng)用(13,25,32,4,74),但對于其中的好些化合物參與折疊的作用機制我們還了解不多。但由于包涵體還含有其它的細胞成分,如膜蛋白、磷脂、核酸,可能影響蛋白質(zhì)的復性(53,54),為了進一步提高純度,有些研究工作在包涵體變性后先進行蛋白的純化,如親和層析(47,55,57,60,63,64,65, 68)、離子交換層析(47,56)、凝膠過濾層析、反相層析(62),再進行變性蛋白質(zhì)的復性,層析在變性條件下應(yīng)用為這一策略提供了技術(shù)支持。已經(jīng)發(fā)展了很多的方法用于包涵體的折疊復性,但是這些方法的結(jié)果并不可預測,每一種方法都需要對各種實驗條件,如變性劑濃度、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度、離子強度、添加劑的濃度,進行優(yōu)化選擇。聯(lián)合使用高壓和低濃度的變性劑已用于包涵體蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體的變性,是一種有前景的變性方法(31,83)。但采用的高pH條件可以使氨基酸殘基發(fā)生化學修飾,還需要更多的驗證(73)。除此之外,改變pH和使用表面活性劑也被用于溶解包涵體蛋白質(zhì)(22),相對而言,這兩種方法的應(yīng)用較少,而且只有具有正確二硫鍵的包涵體蛋白質(zhì)才可以用表面活性劑進行溶解,否則可同時形成正確的和非正確的二硫鍵,表明用尿素、鹽酸胍變性和用表面活性劑變性對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動力學有不同的影響,Tsumoto在這方面做了詳細的論述(25)。由于鹽酸胍溶解包涵體蛋白質(zhì)能力比尿素強,而且尿素中的異氰酸酯可以使自由氨基氨甲?;ㄟ@種作用在堿性條件下表現(xiàn)的更強),所以常常首選鹽酸胍作為解離劑。細胞破碎后,通過離心的方法可以很方便的回收包涵體,再用洗滌液(通常含有低濃度的變性劑,表面活性劑,還原劑,EDTA)對包涵體進行清洗,就可以得到較純的包涵體(4,74)。這兩個例子都說明折疊機制的復雜性,也與上面所介紹的理論相吻合。這一理論認為結(jié)構(gòu)同源的蛋白質(zhì)可以通過不同的折疊途徑形成相似的天然構(gòu)象,人酸性成纖維生長因子(hFGF1)和蠑螈酸性成纖維生長因子(nFGF1)氨基酸序列具有約80%同源性,并且具有結(jié)構(gòu)同源性(12個β折疊反向平行排列形成β折疊桶),在鹽酸胍誘導去折疊的過程中,hFGF1可以監(jiān)測到具有熔球體樣的折疊中間體,而nFGF1經(jīng)由兩態(tài)(天然狀態(tài)到變性狀態(tài))去折疊,沒有檢測到中間體的存在,折疊的動力學研究也表明兩種蛋白采用不同的折疊機制(38)。后來的研究表明折疊過程存在實驗可測的多種中間體,折疊通過有限的路徑進行。在蛋白質(zhì)的折疊過程中,有許多作用 力參與,包括一些構(gòu)象的空間阻礙,范德華力,氫鍵的相互作用,疏水效應(yīng),離子相互作用,多肽和周圍溶劑相互作用產(chǎn)生的熵驅(qū)動的折疊(12,52),但對于蛋白質(zhì)獲得天然結(jié)構(gòu)這一復雜過程的特異性,我們還知之甚少,許多實驗和理論的工作都在加深我們對折疊的認識,但是問題仍然沒有解決。這一理論有兩個關(guān)鍵點:1蛋白質(zhì)的狀態(tài)處于去折疊和天然構(gòu)象的平衡中;2 天 然構(gòu)象的蛋白質(zhì)處于熱力學最低的能量狀態(tài)。 蛋白質(zhì)折疊的過程和機理對蛋白質(zhì)折疊機理的研究,對保留蛋白質(zhì)活性,維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和包涵體蛋白質(zhì)折疊復性都具有重要的意義(21)。通常從包涵體中回收活性蛋白質(zhì)包括三個步驟:包涵體的分離和洗滌,包涵體蛋白質(zhì)的溶解和溶解蛋白質(zhì)的再折疊。這一圖示所展示的規(guī)律對所有蛋白并不是統(tǒng)一的,但它向我們描述了一個大概的情況,在這一過程,不僅僅要考慮變性劑對天然構(gòu)象和折疊中間體的穩(wěn)定作用,還要考慮對蛋白溶解性的影響。所以選擇b區(qū)段所在的變性劑濃度來進行蛋白質(zhì)的折疊更為有效,這一區(qū)段即可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象,而且可以增加天然構(gòu)象蛋白質(zhì)的溶解性,對于部分折疊的中間體卻沒有穩(wěn)定作用。在高的變性劑濃度條件下,蛋白質(zhì)的極性和非極性側(cè)鏈都是可溶的,但是蛋白質(zhì)卻是去折疊的,如圖2中d所標的區(qū)段。 圖2:在各種變性劑濃度條件下蛋白質(zhì)的溶解性和構(gòu)象。所以如果對于包涵體蛋白質(zhì),通過機制的研究,能夠解決折疊復性的問題,那么利用包涵體的高水平表達,就可以得到大量的蛋白質(zhì),降低生產(chǎn)的成本。采用酵母表 達系統(tǒng),可直接產(chǎn)生具有活性的蛋白質(zhì),但是表達的水平和蛋白質(zhì)的回收率較低,采用大腸桿菌表達則形成包涵體,包涵體蛋白質(zhì)的折疊復性非常困難,改善蛋白質(zhì) 的折疊復性具有實際的應(yīng)用意義。所以如果包涵體蛋 白可以進行體外的正確折疊,那么形成包涵體就可以接受,對易受細菌蛋白酶降解的蛋白質(zhì)或?qū)毦卸拘缘牡鞍踪|(zhì)來說,表達產(chǎn)生包涵體是絕對必要的。由于影響蛋白質(zhì)細胞合成和
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