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重組蛋白和多肽的分離純化-文庫(kù)吧資料

2025-06-25 05:15本頁(yè)面
  

【正文】 ++++親和層析基于蛋白質(zhì)和親和配體的特異性相互作用,是最為高效的分離純化方法,用于親和層析的配體可以是針對(duì)抗原的抗體、針對(duì)蛋白質(zhì)分子的受體、酶的底物或抑制劑、針對(duì)糖分子的凝集素、活性染料、金屬離子、天然或改造過(guò)的相互作用多肽等等。傳統(tǒng)的片狀羥基磷灰石物理和化學(xué)穩(wěn)定性比較差,僅能在 低流速條件下使用,新的球形羥基磷灰石克服了以上缺點(diǎn),對(duì)于其它方法不易分離的蛋白質(zhì),可以用羥基磷灰石層析進(jìn)行分離純化。疏水層析的選擇性依賴于疏水配體的結(jié)構(gòu),有烷基配體和芳香基配體,烷基的鏈越長(zhǎng),蛋白質(zhì)的保留就越強(qiáng)。離子交換層析基于蛋白質(zhì)與離子交換介質(zhì)電荷間的相互作用,高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn),蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷,低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)蛋白質(zhì)帶 正電荷,不同的蛋白質(zhì)在一定的pH條 件下與介質(zhì)上的離子之間相互作用不同,而產(chǎn)生不同的選擇性,根據(jù)帶電基團(tuán)的類型和強(qiáng)度可分為四種類型:強(qiáng)陰離子交換層析、弱陰離子交換層析、強(qiáng)陽(yáng)離子交換 層析、弱陽(yáng)離子交換層析,通常采用一定的平衡條件使目標(biāo)蛋白選擇性的吸附在介質(zhì)上,也可以使雜蛋白吸附,而目標(biāo)蛋白選擇性的穿過(guò)。在 重組蛋白的分離純化中,各種分離模式都得到應(yīng)用。層析技術(shù)的另一個(gè)發(fā)展方向是功能基團(tuán)的發(fā)展,適應(yīng)不同的選擇性要求,如各種不同 親和層析介質(zhì)的合成,使一步純化就能達(dá)到很高的純度。由于蛋白質(zhì)大分子具有高的親水性,要求分離介質(zhì)具有親水的界面,為活性大分子提供適宜的微環(huán)境,早期的離子交換介質(zhì)不具有親水的特性和大的孔結(jié)構(gòu),僅用于小分子的分離純化,Peterson 和 Sober 等在離子交換介質(zhì)的研究上進(jìn)行了開(kāi)拓性的工作,選擇特定的纖維素作為離子交換基團(tuán)的基質(zhì),合成的離子交換纖維素介質(zhì)具有高的結(jié)合容量和低的不可逆性吸附,并得到實(shí)際應(yīng)用(89,90)。 層析技術(shù)在分離純化中的應(yīng)用層析技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離純化開(kāi)始于60年代,現(xiàn)在已成為蛋白質(zhì)分離純化的高分辨的方法。膜分離技術(shù)和沉淀分離技術(shù)是兩種傳統(tǒng)的技術(shù),不管在實(shí)驗(yàn)室研究,還是在工業(yè)的生產(chǎn)上都有 應(yīng)用,近年來(lái)功能性膜的應(yīng)用和膜色譜的發(fā)展大大擴(kuò)展了膜分離的應(yīng)用領(lǐng)域,而親和技術(shù)和沉淀分離相結(jié)合產(chǎn)生了親和沉淀技術(shù),提高了分離的特異性。在膜蛋白的整個(gè)分離純化過(guò)程中,都要使用表面活性劑來(lái)模擬脂質(zhì)的功能,但膠束與蛋白質(zhì)的相互作用 常常降低層析的分辨率,而且聚集的情況更容易發(fā)生,所以在特定的純化階段選擇哪一種表面活性劑,以及使用多大的濃度,對(duì)分離純化的影響最為關(guān)鍵(88)。對(duì)于表達(dá)于細(xì)胞膜的蛋白質(zhì),先要破碎細(xì)胞后分離細(xì)胞膜,再抽提溶液進(jìn)行膜蛋白的提取,由于膜蛋白具有疏水區(qū)域,在抽提溶液中需要加入表面活性劑,一方面破壞細(xì)胞膜,溶解膜結(jié)構(gòu),另一方面促進(jìn)膜蛋白的溶解和穩(wěn)定,常用Triton X100、 脫氧膽酸鈉、Brij等弱的表面活性劑來(lái)保留蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。對(duì)于分泌到周質(zhì)間隙的蛋白質(zhì),使用滲透壓沖擊,凍融法,溶菌酶處理方法可以使目標(biāo)蛋白釋放。大部分的可溶性重組 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),而一些膜蛋白常常表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)膜上,還有一些則分泌到細(xì)菌的周質(zhì)間隙或細(xì)胞外。重 組蛋白在大腸桿菌中得到表達(dá)以后,首先必須從細(xì)菌釋放才能進(jìn)行下游的分離純化過(guò)程。在單鏈抗體Fv段的透析復(fù)性中,加入固定化的氧化還原酶DsbA和DsbC可以顯著提高折疊的效率,得到的單鏈抗體Fv段和天然抗體Fv段具有相同的功能(46)。分子伴侶和折疊酶在體外有兩個(gè)方面的應(yīng)用,其一是在溶液中加入伴侶分子和/或折疊酶促進(jìn)包涵體蛋白質(zhì)的折疊和裝配(39),另一方面就是通過(guò)固定化的伴侶分子和/或折疊酶來(lái)介導(dǎo)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性。酮戊二酸載體蛋白是線粒體內(nèi)膜上的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, C41(DE3)作為宿主菌使C端帶有組氨酸標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白形成包涵體獲得大量表達(dá),再用鎳柱親和色譜進(jìn)行復(fù)性和純化,獲得的融合蛋白具有和天然蛋白一樣的轉(zhuǎn)運(yùn)活性,每升的細(xì)菌培養(yǎng)液可獲得15mg的活性蛋白(50)。Zahn等在鎳親和層析柱(NiNTA argrose)上通過(guò)鹽酸胍/谷胱甘肽梯度進(jìn)行帶有組氨酸標(biāo)簽的人朊病毒蛋白多肽片段的氧化再折疊,抑制了蛋白質(zhì)聚集和分子間二硫鍵的形成,再用咪唑緩沖液對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行洗脫,純化的流程圖如圖4所示(20)。多肽通過(guò)在N端或C端加上一個(gè)親和標(biāo)簽,在包涵體的純化上有兩個(gè)方面的用途,其一是包涵體變性溶解后,利用親和色譜直接進(jìn)行包涵體溶液的純化,再用稀釋或透析的方法進(jìn)行復(fù)性(55,57,60,64,65,68),其二就是用于親和色譜復(fù)性(61,66,67,69,70)。由于蛋白質(zhì)結(jié)合在固相介質(zhì)上,減少了折疊過(guò)程中由于分子間相互作用所造成的聚集,所以這一方法可提高折疊的效率。另外應(yīng)用連續(xù)環(huán)形色譜,蛋白樣品連續(xù)上樣于旋轉(zhuǎn)的色譜柱上,在提高折疊效率的同時(shí),也提高了色譜復(fù)性處理的能力(29,30)。通過(guò)尿素線性梯度復(fù)性,變性溶菌酶以 高蛋白濃度上樣(17mg/ml)可以獲得90%的活性回收率,與稀釋復(fù)性和非梯度凝膠過(guò)濾復(fù)性相比較,顯著的改善了活性回收率(27)。通常選擇線性的梯度用于折疊復(fù)性,對(duì)于不同的蛋白質(zhì)還有其它的模式,如一些蛋白在特定的變性劑濃度范圍里不穩(wěn)定,在此變性 劑濃度范圍里就需要快速降低變性劑濃度。ller等用雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體同時(shí)表達(dá)等摩爾的A鏈和B鏈,但以包涵體的形式存在,為了得到活性的異源二聚體PDGFAB,包涵體用鹽酸胍變性后,先在變性條件下用凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化,使用稀釋復(fù)性,蛋白質(zhì)嚴(yán)重聚集,即使在10μg/ml蛋白質(zhì)濃度條件下,也只能得到45%可溶性蛋白,而用凝膠過(guò)濾復(fù)性,同時(shí)洗脫的A亞基和B亞基可以緩慢二聚化產(chǎn)生異源二聚體,,最終異源二聚體得率可達(dá)75%(26)。A. 凝膠過(guò)濾色譜復(fù)性凝膠過(guò)濾復(fù)性時(shí),變性蛋白質(zhì)加樣于折疊緩沖液平衡好的凝膠過(guò)濾柱上,然后用折疊緩沖液進(jìn)行洗脫,凝膠過(guò)濾層析有不同的分子量分級(jí)范圍,有助于聚集蛋白質(zhì)和正確折疊蛋白質(zhì)的分離。在折疊中,吸附的位點(diǎn)會(huì)影響到折疊,所以要優(yōu)化折疊的條件,才能得到好的折疊效果。復(fù)性折疊中存在的一個(gè)問(wèn)題就是蛋白質(zhì)的聚集,為了減少導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集的分子間相互作用,可將蛋白質(zhì)結(jié)合在分離介質(zhì)上,達(dá) 到溶液中變性劑濃度的稀釋和蛋白質(zhì)的折疊,這一類型的復(fù)性為吸附型色譜復(fù)性,包括親和色譜復(fù)性,疏水相互作用色譜復(fù)性,離子交換色譜復(fù)性。色譜復(fù)性的方法的優(yōu)點(diǎn)是可以顯著的減少處理的時(shí)間,減少變復(fù)性過(guò)程中分 子的聚集,使復(fù)性的同時(shí)也達(dá)到了純化的效果。溶解復(fù)性獲得的蛋白質(zhì),需要通過(guò)離心和過(guò)濾的方法去除 不溶性的物質(zhì),再按可溶性蛋白質(zhì)的處理方法進(jìn)行下游的分離純化。Arora等將這一方法用于人γ干擾素的復(fù)性,產(chǎn)品的得率和比活比文獻(xiàn)報(bào)道的都要高(72)。這個(gè)研究小組用相同的方法進(jìn)行白介素12包涵體的折疊復(fù)性,僅加入氧化型谷胱甘肽而沒(méi)有還原型谷胱甘肽只有約57%的折疊效率,當(dāng)兩者同時(shí)加入后則可達(dá)到90%(42),這些結(jié)果表明前一種蛋白比較容易形成正確的二硫鍵,而白介素12折疊復(fù)性需要加入還原型的谷胱甘肽促進(jìn)二硫鍵重組,使蛋白質(zhì)最終選擇天然的二硫鍵,并促進(jìn)折疊。在胰凝乳蛋白酶原的折疊復(fù)性中, M或高于3 M都會(huì)造成大量的沉淀, M濃度時(shí)有一半的蛋白質(zhì)沒(méi)有正確折疊,而在1 M時(shí)則完全折疊,說(shuō)明折疊時(shí)的變性劑并不是越低越好,而是存在一個(gè)最佳濃度(13)。變性劑濃度的降低也可以分階段的進(jìn)行,或先經(jīng)過(guò)稀釋,再透析去除剩余的變性劑,由于變性劑的濃度在開(kāi)始時(shí)先降到一定的水平,增加了部分折疊中間體的溶解性,常??梢蕴岣哒郫B的效率,但是必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇在不同階段使用的變性劑濃度,避開(kāi)圖2 所示的c區(qū)段。對(duì)于折疊,是一個(gè)一級(jí)的反應(yīng)過(guò)程,而聚集是一個(gè)高級(jí)的反應(yīng)過(guò)程,依賴蛋白質(zhì)的濃度,所以 需要小心的選擇蛋白質(zhì)的濃度,一般的蛋白質(zhì)的終濃度保持在2050μg/mL。為了很快避開(kāi)低溶解性變性劑區(qū)(如圖2中c區(qū) 段所示),減少蛋白的聚集,在進(jìn)行稀釋時(shí)一定要快速。此外,在前胰島素的折疊復(fù)性中也應(yīng)用了磺酸化保護(hù)(44,47,48),所以這一方法在進(jìn)行復(fù)雜蛋白的變復(fù)性時(shí)可以采用。人組織纖溶酶原激活劑(tPA)含有35個(gè)半胱氨酸殘基,可形成17對(duì)二硫鍵,即使在天然狀態(tài)下也只具有低的溶解性,進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)這兩種巰基保護(hù)方法都被用于該蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性,由于在蛋白質(zhì)的巰基上引入了帶電荷的殘基,增加了變性蛋白和部分折疊中間體的溶解性,減少了復(fù)性過(guò)程中蛋白質(zhì)的聚集,可獲得較高的復(fù)性效率(25,32,33)。常用的方法有:1 使用金屬催化的空氣氧化,并添加還原劑促進(jìn)二硫鍵改組,由于氧在蛋白質(zhì)溶液中溶解性低,這種方法的效率較低,改用攪拌促進(jìn)氧的質(zhì)量傳輸,又會(huì)造成蛋白質(zhì)的聚集;2 使用小分子還原型和氧化型的巰基試劑對(duì),包括還原型和氧化型的谷胱甘肽(GSH/GSSG)、半胱氨酸和胱氨酸(cysteine/cystine)、半胱胺和胱胺(cysteamine/cystamine)、二硫蘇糖醇和氧化型谷胱甘肽(DTT/GSSG),二流赤蘚糖醇和氧化型谷胱甘肽(DTE/GSSG),這一方法是目前常用的方法,通常使用的巰基試劑總濃度為515mM,還原劑和氧化劑的比為5:1―1:1(4,74)。另一種方法就是加入添加劑來(lái)減少聚集,促進(jìn)折疊,如L精氨酸,鹽,有機(jī)溶劑,一些表面活性劑,滲透壓調(diào)節(jié)劑(osmolytes),硫代甜菜堿類物質(zhì)(NDSBs),這些物質(zhì)或穩(wěn)定蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象,或使部分折疊的中間體不穩(wěn)定,表2 列出了這些化合物和它們可能的作用機(jī)制,它們?cè)诘鞍踪|(zhì)的折疊中起著重要的作用,已得到廣泛的應(yīng)用(13,25,32,4,74),但對(duì)于其中的好些化合物參與折疊的作用機(jī)制我們還了解不多。但由于包涵體還含有其它的細(xì)胞成分,如膜蛋白、磷脂、核酸,可能影響蛋白質(zhì)的復(fù)性(53,54),為了進(jìn)一步提高純度,有些研究工作在包涵體變性后先進(jìn)行蛋白的純化,如親和層析(47,55,57,60,63,64,65, 68)、離子交換層析(47,56)、凝膠過(guò)濾層析、反相層析(62),再進(jìn)行變性蛋白質(zhì)的復(fù)性,層析在變性條件下應(yīng)用為這一策略提供了技術(shù)支持。已經(jīng)發(fā)展了很多的方法用于包涵體的折疊復(fù)性,但是這些方法的結(jié)果并不可預(yù)測(cè),每一種方法都需要對(duì)各種實(shí)驗(yàn)條件,如變性劑濃度、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度、添加劑的濃度,進(jìn)行優(yōu)化選擇。聯(lián)合使用高壓和低濃度的變性劑已用于包涵體蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體的變性,是一種有前景的變性方法(31,83)。但采用的高pH條件可以使氨基酸殘基發(fā)生化學(xué)修飾,還需要更多的驗(yàn)證(73)。除此之外,改變pH和使用表面活性劑也被用于溶解包涵體蛋白質(zhì)(22),相對(duì)而言,這兩種方法的應(yīng)用較少,而且只有具有正確二硫鍵的包涵體蛋白質(zhì)才可以用表面活性劑進(jìn)行溶解,否則可同時(shí)形成正確的和非正確的二硫鍵,表明用尿素、鹽酸胍變性和用表面活性劑變性對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)有不同的影響,Tsumoto在這方面做了詳細(xì)的論述(25)。由于鹽酸胍溶解包涵體蛋白質(zhì)能力比尿素強(qiáng),而且尿素中的異氰酸酯可以使自由氨基氨甲?;ㄟ@種作用在堿性條件下表現(xiàn)的更強(qiáng)),所以常常首選鹽酸胍作為解離劑。細(xì)胞破碎后,通過(guò)離心的方法可以很方便的回收包涵體,再用洗滌液(通常含有低濃度的變性劑,表面活性劑,還原劑,EDTA)對(duì)包涵體進(jìn)行清洗,就可以得到較純的包涵體(4,74)。這兩個(gè)例子都說(shuō)明折疊機(jī)制的復(fù)雜性,也與上面所介紹的理論相吻合。這一理論認(rèn)為結(jié)構(gòu)同源的蛋白質(zhì)可以通過(guò)不同的折疊途徑形成相似的天然構(gòu)象,人酸性成纖維生長(zhǎng)因子(hFGF1)和蠑螈酸性成纖維生長(zhǎng)因子(nFGF1)氨基酸序列具有約80%同源性,并且具有結(jié)構(gòu)同源性(12個(gè)β折疊反向平行排列形成β折疊桶),在鹽酸胍誘導(dǎo)去折疊的過(guò)程中,hFGF1可以監(jiān)測(cè)到具有熔球體樣的折疊中間體,而nFGF1經(jīng)由兩態(tài)(天然狀態(tài)到變性狀態(tài))去折疊,沒(méi)有檢測(cè)到中間體的存在,折疊的動(dòng)力學(xué)研究也表明兩種蛋白采用不同的折疊機(jī)制(38)。后來(lái)的研究表明折疊過(guò)程存在實(shí)驗(yàn)可測(cè)的多種中間體,折疊通過(guò)有限的路徑進(jìn)行。在蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程中,有許多作用 力參與,包括一些構(gòu)象的空間阻礙,范德華力,氫鍵的相互作用,疏水效應(yīng),離子相互作用,多肽和周圍溶劑相互作用產(chǎn)生的熵驅(qū)動(dòng)的折疊(12,52),但對(duì)于蛋白質(zhì)獲得天然結(jié)構(gòu)這一復(fù)雜過(guò)程的特異性,我們還知之甚少,許多實(shí)驗(yàn)和理論的工作都在加深我們對(duì)折疊的認(rèn)識(shí),但是問(wèn)題仍然沒(méi)有解決。這一理論有兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn):1蛋白質(zhì)的狀態(tài)處于去折疊和天然構(gòu)象的平衡中;2 天 然構(gòu)象的蛋白質(zhì)處于熱力學(xué)最低的能量狀態(tài)。 蛋白質(zhì)折疊的過(guò)程和機(jī)理對(duì)蛋白質(zhì)折疊機(jī)理的研究,對(duì)保留蛋白質(zhì)活性,維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性都具有重要的意義(21)。通常從包涵體中回收活性蛋白質(zhì)包括三個(gè)步驟:包涵體的分離和洗滌,包涵體蛋白質(zhì)的溶解和溶解蛋白質(zhì)的再折疊。這一圖示所展示的規(guī)律對(duì)所有蛋白并不是統(tǒng)一的,但它向我們描述了一個(gè)大概的情況,在這一過(guò)程,不僅僅要考慮變性劑對(duì)天然構(gòu)象和折疊中間體的穩(wěn)定作用,還要考慮對(duì)蛋白溶解性的影響。所以選擇b區(qū)段所在的變性劑濃度來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)的折疊更為有效,這一區(qū)段即可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象,而且可以增加天然構(gòu)象蛋白質(zhì)的溶解性,對(duì)于部分折疊的中間體卻沒(méi)有穩(wěn)定作用。在高的變性劑濃度條件下,蛋白質(zhì)的極性和非極性側(cè)鏈都是可溶的,但是蛋白質(zhì)卻是去折疊的,如圖2中d所標(biāo)的區(qū)段。 圖2:在各種變性劑濃度條件下蛋白質(zhì)的溶解性和構(gòu)象。所以如果對(duì)于包涵體蛋白質(zhì),通過(guò)機(jī)制的研究,能夠解決折疊復(fù)性的問(wèn)題,那么利用包涵體的高水平表達(dá),就可以得到大量的蛋白質(zhì),降低生產(chǎn)的成本。采用酵母表 達(dá)系統(tǒng),可直接產(chǎn)生具有活性的蛋白質(zhì),但是表達(dá)的水平和蛋白質(zhì)的回收率較低,采用大腸桿菌表達(dá)則形成包涵體,包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性非常困難,改善蛋白質(zhì) 的折疊復(fù)性具有實(shí)際的應(yīng)用意義。所以如果包涵體蛋 白可以進(jìn)行體外的正確折疊,那么形成包涵體就可以接受,對(duì)易受細(xì)菌蛋白酶降解的蛋白質(zhì)或?qū)?xì)菌有毒性的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō),表達(dá)產(chǎn)生包涵體是絕對(duì)必要的。由于影響蛋白質(zhì)細(xì)胞合成和
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