【正文】 大小結(jié)合配體融合部位洗脫條件注釋谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)26 kDa(.)谷胱甘肽N 端還原型谷胱甘肽載體:pGEX, pET41, pET42, 可進(jìn)行表達(dá)蛋白的檢測(cè),融合蛋白形成二聚體金葡菌蛋白A(Protein A) IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域30 kDahIgGN 端低pH載體:pRIT2T, 具有Protein A信號(hào)序列可進(jìn)行分泌表達(dá),可在弱變性條件下純化（）ZZ 結(jié)構(gòu)域14 kDahIgGN 端低pH載體:pEZZ18, 具有Protein A信號(hào)序列可進(jìn)行分泌表達(dá),可使目標(biāo)蛋白獲得正確的折疊鏈球菌蛋白G(Protein G)28 kDa白蛋白(HSA)N 端或C端低pH具有Protein G信號(hào)序列可進(jìn)行分泌表達(dá)白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)525 kDa白蛋白(HSA)C 端低pH 親和標(biāo)簽的去除盡管親和融合策略可以一步使融合蛋白的純度達(dá)到很高，但是在蛋白質(zhì)的下游處理階段又引入了新的問(wèn)題，即需要位點(diǎn)特異的剪切。如果使用蛋白酶進(jìn)行特異性剪切，在酶切完成后要有相應(yīng)去除蛋白酶的純化方法，有的重組蛋白酶具有親和標(biāo)簽，如N端帶有His標(biāo)簽的腸激酶、二肽氨基肽酶和TEV蛋白酶，可在酶切后使用金屬螯合親和層析去除，N端帶有GST標(biāo)簽的PreScission蛋 白酶，可以用谷胱甘肽親和層析柱去除，還可以將蛋白酶固定化在介質(zhì)上進(jìn)行融合蛋白的酶切，使蛋白酶可重復(fù)使用。表 5 融合蛋白的剪切方法剪切的方法剪切位點(diǎn)序列注釋 酶法腸激酶AspAspAspAspLys^重組的蛋白酶，為內(nèi)切酶，如果在賴氨酸后為脯氨酸則不能剪切，在其它的堿性氨基酸殘基后有非特異性剪切，溫度范圍為4℃到45℃凝血因子Ⅹa蛋白酶IleGlu/AspGlyArg^如果在精氨酸后為脯氨酸和精氨酸則不能剪切，為內(nèi)切酶，在GlyArg后存在非特異性剪切凝血酶LeuValProArg^GlySer牛來(lái)源的含有其它蛋白質(zhì)，為內(nèi)切酶，存在非特異性的剪切，生物素化后可用鏈霉抗生物素蛋白親和層析清除PreScission 蛋白酶LeuGluValLeuPheGln^GlyProGST融合的鼻病毒3C蛋白酶，為內(nèi)切酶，4℃具有最優(yōu)活性rTEV蛋白酶GluAsnLeuTyrPheGln^Gly重組的煙草蝕紋病毒蛋白酶，具有8個(gè)氨基酸識(shí)別位點(diǎn)，高特異性，為內(nèi)切酶，在寬的溫度范圍里具有活性，與Histag融合后，酶切后使用金屬螯合親和層析清除二肽基氨基肽酶(Xaa)2n^XaaPro, (Xaa)2n^Xaa Xaa –Pro,1His標(biāo) 簽也有一些缺點(diǎn)，如融合蛋白易形成包涵體，包涵體蛋白難于溶解，融合蛋白溶解后不能正確復(fù)性，層析時(shí)螯和的金屬離子容易泄漏（會(huì)使蛋白的氨基酸側(cè)鏈氧化， 純化的得率降低，制品中殘留金屬離子對(duì)細(xì)胞、組織有毒性），金屬鰲和親和層析的非特異性結(jié)合會(huì)造成制品的純度不高，針對(duì)這些問(wèn)題，現(xiàn)在發(fā)展的 His親和表達(dá)純化系統(tǒng)克服了其中的某些缺點(diǎn)，如使用結(jié)合金屬離子強(qiáng)的親和介質(zhì)NiNTA和TALON，使用HAT標(biāo)簽（HAT標(biāo)簽為雞乳酸脫氫酶的一段序列），六個(gè)組氨酸被其它氨基酸隔開(kāi)，沒(méi)有正電荷聚集的現(xiàn)象，可改善溶解性和得率。2用于親和純化的GST來(lái)源于日本血吸蟲(chóng)，由于其分子量較大，而且以二聚體的形式存在溶液中，一般都需要去除融合標(biāo)簽。3Protein A前體蛋白由信號(hào)肽序列、5個(gè)同源的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞表面錨定序列組成，同源的5個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠分別結(jié)合IgG，Protein A已廣泛的用于抗體的純化。由于基于Protein A的親和標(biāo)簽的親和性比較高，要在相對(duì)劇烈的條件下（低pH）進(jìn)行洗脫，所以可能造成目標(biāo)蛋白的失活，另一個(gè)問(wèn)題就是IgG親和層析介質(zhì)較貴，并且不耐清洗處理。白蛋白結(jié)合區(qū)域在大腸桿菌中表達(dá)高度可溶，性質(zhì)穩(wěn)定，不被蛋白酶降解，結(jié)合上信號(hào)肽能有效的分泌。4體外也可對(duì)蛋白賴氨酸殘基進(jìn)行生物素化標(biāo)記，但不具有特異性，不能用于親和純化，研究者轉(zhuǎn)向?qū)ふ殷w內(nèi)可特異性生物素化的多肽，并把它用于親和融合策略。 很少有蛋白在體內(nèi)可以被生物素化修飾，乙酰輔酶A的生物素羧基載體蛋白（BCCP）是存在于大腸桿菌（E. coli）的唯一一個(gè)可生物素化蛋白，生物素在生物素連接酶（BirA）的催化下特異性的修飾其中的一個(gè)賴氨酸殘基，研究表明其C末段101個(gè)氨基酸的肽段已經(jīng)具有可被生物素化的功能，Promega的PinPoint載體就編碼這個(gè)標(biāo)簽，使用其SoftLink親和素（即抗生物素蛋白）介質(zhì)可以在弱的條件下洗脫融合蛋白（5mM生物素溶液）。 Strep Tag 系統(tǒng)是通過(guò)篩選噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)而得到的短肽（含9個(gè)氨基酸殘基），將其進(jìn)行目標(biāo)蛋白的C端融合可以模擬生物素和鏈霉抗生物素蛋白特異性相互作用，使用亞胺生物素洗脫。 大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白是malE基因的產(chǎn)物，定位在細(xì)胞的周質(zhì)空間，可以特異性的結(jié)合麥芽糖或糊精麥芽糖復(fù)合物，協(xié)助這些物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。6 纖維素結(jié)合肽（CBD）融合蛋白能與纖維素介質(zhì)特異性的結(jié)合，可以在溫和的條件下洗脫（乙二醇或低鹽條件），pET CBD 載體含有纖維素結(jié)合肽（CBD）的序列，可方便克隆構(gòu)建。與傳統(tǒng)的親和融合系統(tǒng)相比，這一系統(tǒng)的最大優(yōu)點(diǎn)在于不需要使用蛋白酶來(lái)去除融合標(biāo)簽。 FLAG肽序列（DYKDDDDK）的親水性很強(qiáng)，片段小，并且具有腸激酶的酶切位點(diǎn)，一般不會(huì)影響目標(biāo)蛋白的活性。這一系統(tǒng)可在多種表達(dá)系統(tǒng)中使用，主要的缺點(diǎn)是M1和M2親和介質(zhì)特別昂貴。16 / 16。S標(biāo)簽為15 個(gè)氨基酸的多肽標(biāo)簽，可以特異性的和S蛋白介質(zhì)結(jié)合。抗FLAG的單克隆抗體M1和FLAG結(jié)合是Ca2+依賴的，加入螯和劑可以在溫和的條件下將融合蛋白洗脫，但M1 抗體只能結(jié)合處在N端最外面的FLAG標(biāo)簽，所以只可用于去除信號(hào)肽后的FLAG融合蛋白。 FLAG表位標(biāo)簽，T7表位標(biāo)簽和S標(biāo)簽 New England Biolabs 提供的IMPACT（InteinMediated Purification with an affinity Chitinbinding Tag）系統(tǒng)使用幾丁質(zhì)結(jié)合肽（來(lái)源于環(huán)狀芽胞桿菌）作為融合標(biāo)簽，表達(dá)的融合蛋白可以用幾丁質(zhì)親和層析純化，利用內(nèi)含肽（intein）的特異性原位剪切直接獲得目標(biāo)蛋白。這一系統(tǒng)有如下優(yōu)點(diǎn)：1 特異性很高，因?yàn)榇竽c桿菌沒(méi)有可以和鈣調(diào)素結(jié)合的蛋白；2 與His標(biāo)簽相比可以在強(qiáng)還原性條件下純化。 鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP）與硫氧還蛋白不同，MBP進(jìn)行C端融合也可以促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)（107），擴(kuò)展了MBP的應(yīng)用。 AviTag由篩選肽庫(kù)得到15 個(gè)氨基酸的短肽，具有一個(gè)單生物素化賴氨酸位點(diǎn)，與已知天然可生物素化一致序列完全不同，可以加在目標(biāo)蛋白的N端和C端，融合表達(dá)后，可被生物素連接酶BirA（細(xì)菌具有內(nèi)源性的生物素連接酶，但為了使重組蛋白完全生物素化，感受態(tài)細(xì)菌已轉(zhuǎn)化高水平表達(dá)生物素連接酶的質(zhì)粒）生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質(zhì)分離純化，還用于蛋白質(zhì)相互作用研究。后來(lái)發(fā)展的8氨基酸Strep tag Ⅱ標(biāo)簽，與Strep Tag相似，本身并不能生物素化，但卻可以模擬生物素的功能和鏈霉抗生物素蛋白變體StrepTactin特異性的相互作用，可加在蛋白的N端和C端，使用便宜的脫硫生物素進(jìn)行洗脫，而且Strep tag Ⅱ和StrepTactin相互作用不受變性劑的影響，可在變性條件下純化?；赑rotein G的親和標(biāo)簽最重要的用途在于傳輸?shù)鞍踪|(zhì)藥物，融合蛋白的白蛋白結(jié)合特性使得目標(biāo)蛋白的血漿半衰期延長(zhǎng)，增強(qiáng)了療效。lich等對(duì)Protein A進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，降低結(jié)合的強(qiáng)度，（102）。為了使融合蛋白耐溴化氰和羥胺處理，對(duì)5個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的B結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，替換了溴化氰和羥胺處理敏感的氨基酸，就有了Z標(biāo)簽，越來(lái)越多的應(yīng)用更優(yōu)先選用Z標(biāo)簽和它的雙體ZZ標(biāo)簽。GST融合蛋白也常用來(lái)免疫動(dòng)物生產(chǎn)抗體，以及作為載體蛋白進(jìn)行一些蛋白的結(jié)晶。 圖6 用于金屬螯和層析的螯和配體。在親和純化中，常規(guī)使用的介質(zhì)有NiIDA、NiNTA和TALON親和介質(zhì)，圖6 畫(huà)出了相應(yīng)三種螯和配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，最早使用的IDA和Ni2+有三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)在一個(gè)平面上，結(jié)合力也最弱，所以在純化中的泄漏也最多，NTA和Ni2+有4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，TALON和Co2+也有4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，形成立體的結(jié)合，結(jié)合力較強(qiáng)，泄漏也較少。它的主要優(yōu)點(diǎn)如下：1 標(biāo)簽的分子量小，一般不影響目標(biāo)蛋白的功能；2 His表位標(biāo)簽和金屬螯合親和層析Jenny等對(duì)凝血酶和凝血因子Ⅹa蛋白酶的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，認(rèn)為盡管它們?cè)诤芏鄳?yīng)用中能夠在設(shè)計(jì)的位點(diǎn)進(jìn)行特異性酶切，但常常會(huì)發(fā)生目標(biāo)蛋白其它位點(diǎn)的酶解，所以在去除親和標(biāo)簽后要對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒定，以確保蛋白的結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生變化（105）。但如果親和標(biāo)簽影響了目標(biāo)蛋白的功能，或?yàn)榱私Y(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和治療用途，就必須在融合標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白之間加入特異的剪切位點(diǎn)，以便去除親和標(biāo)簽，可用的方法有化學(xué)法和酶法，如表5 所示，在選擇這些方法時(shí)除要考慮選擇性等因素外，還要考慮標(biāo)簽去除后氨基酸的殘留 ，目前C端的標(biāo)簽沒(méi)有很好的方法去除，都會(huì)在目標(biāo)蛋白的C端引入額外的氨基酸，針對(duì)N端標(biāo)簽已有幾種蛋白酶在酶切后可使目標(biāo)蛋白不帶額外的氨基酸殘基。pFLAG,p3FLAG,已具有腸激酶酶切位點(diǎn)S 標(biāo)簽15 .RNase A的S片段N 端或C 端低pH載體:pET,可進(jìn)行表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)T7 標(biāo)簽11 .單抗N 端低pH載體:pET,可增強(qiáng)表達(dá)水平,可在弱變性條件下純化精氨酸標(biāo)簽(Poly Arg)515 .強(qiáng)酸性陽(yáng)離子基團(tuán)C 端氯化鈉梯度 親和洗脫的條件表4 列出了親和洗脫的條件，有些條件比較溫和，而有些條件較為劇烈，選擇的親和表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)該不使目標(biāo)蛋白變性。 在選擇融合位置時(shí)，另一個(gè)方面的考慮是，C端融合在去除融合標(biāo)簽后在目標(biāo)蛋白的C端會(huì)有幾個(gè)氨基酸殘留，而小心的選擇剪切特異性的氨基酸序列就可以在去除N端親和標(biāo)簽后得到天然的目標(biāo)蛋白。多數(shù)情況下蛋白質(zhì)的N端區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)的功能不是太重要，所以在N端進(jìn)行融合標(biāo)簽的融合常常能保留蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。如麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）具有分子伴侶樣的特性，進(jìn)行N端融合，常有助于蛋白質(zhì)的正確折疊和活性蛋白的獲得，目的蛋白的MBP融合已成功用于晶體結(jié)構(gòu)的研究（95）。 親和標(biāo)簽是否會(huì)影響到目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能親 和標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白之間的作用是相互的，需要綜合的考慮，既要考慮到對(duì)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)功能的影響，又要考慮到對(duì)標(biāo)簽與其配體親和作用的影響，以及實(shí)際的用途。3.但要注意的是可溶性表達(dá)并不能保證正確的折疊，融合蛋白可以形成可溶性的聚集體（106）?；谥亟M蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合特性，一些重組蛋白質(zhì)應(yīng)用親和層析進(jìn)行純 化，如將抗體、受體或體外噬菌體展示技術(shù)篩選的親和體（affibody）偶聯(lián)在親和介質(zhì)上進(jìn)行親和純化，但這類應(yīng)用僅限于特定的蛋白質(zhì)，而利用DNA重組技術(shù)使目標(biāo)蛋白與親和標(biāo)簽融合表達(dá)，控制重組分子的親和選擇性，進(jìn)行融合蛋白的親和純化，已成為純化重組蛋白的常用遺傳策略。表 3 常用層析方法的分離特點(diǎn)和不同純化階段的適用性層析方法親和層析凝膠過(guò)濾層析離子交換層析疏水層析分離機(jī)制特異性親和大小電荷疏水性選擇性非常高中等高高→中等載量高低高高純化速度中等中等→低高高生物相容性好非常好好中等→好目標(biāo)蛋白的得率高高高中等→高捕獲濃縮階段++++++++++中間純化階段++++++++++精制純化階段+++++++++傳統(tǒng)的片狀羥基磷灰石物理和化學(xué)穩(wěn)定性比較差，僅能在 低流速條件下使用，新的球形羥基磷灰石克服了以上缺點(diǎn)，對(duì)于其它方法不易分離的蛋白質(zhì)，可以用羥基磷灰石層析進(jìn)行分離純化。離子交換層析基于蛋白質(zhì)與離子交換介質(zhì)電荷間的相互作用，高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)蛋白質(zhì)帶 正電荷，不同的蛋白質(zhì)在一定的pH條 件下與介質(zhì)上的離子之間相互作用不同，而產(chǎn)生不同的選擇性，根據(jù)帶電基團(tuán)的類型和強(qiáng)度可分為四種類型：強(qiáng)陰離子交換層析、弱陰離子交換層析、強(qiáng)陽(yáng)離子交換 層析、弱陽(yáng)離子交換層析，通常采用一定的平衡條件使目標(biāo)蛋白選擇性的吸附在介質(zhì)上，也可以使雜蛋白吸附，而目標(biāo)蛋白選擇性的穿過(guò)。層析技術(shù)的另一個(gè)發(fā)展方向是功能基團(tuán)的發(fā)展，適應(yīng)不同的選擇性要求，如各種不同 親和層析介質(zhì)的合成，使一步純化就能達(dá)到很高的純度。 層析技術(shù)在分離純化中的應(yīng)用層析技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離純化開(kāi)始于60年代，現(xiàn)在已成為蛋白質(zhì)分離純化的高分辨的方法。在膜蛋白的整個(gè)分離純化過(guò)程中，都要使用表面活性劑來(lái)模擬脂質(zhì)的功能，但膠束與蛋白質(zhì)的相互作用 常常降低層析的分辨率，而且聚集的情況更容易發(fā)生，所以在特定的純化階段選擇哪一種表面活性劑，以及使用多大的濃度，對(duì)分離純化的影響最為關(guān)鍵（88）。對(duì)于分泌到周質(zhì)間隙的蛋白質(zhì)，使用滲透壓沖擊，凍融法，溶菌酶處理方法可以使目標(biāo)蛋白釋放。重 組蛋白在大腸桿菌中得到表達(dá)以后，首先必須從細(xì)菌釋放才能進(jìn)行下游的分離純化過(guò)程。分子伴侶和折疊酶在體外有兩個(gè)方面的應(yīng)用，其一是在溶液中加入伴侶分子和/或折疊酶促進(jìn)包涵體蛋白質(zhì)的折疊和裝配（