【正文】 折疊的因素太多，優(yōu)化結(jié)果不可預(yù)測，如對于抗體Fab片段，盡管只有可變區(qū)序列不同，也不能預(yù)測新的Fab片段在體內(nèi)是否可以正確折疊（4），所以即使采用了促進可溶性表達(dá)的方法，也不能保證不形成包涵體。蛋白質(zhì)進行可溶性表達(dá)和表達(dá)形成包涵體各有利弊，對許多蛋白，再折疊很困難，或者不可能，進行可溶性的表達(dá)就是首選。膜蛋白具有暴露的疏水區(qū)，表達(dá)時易于聚集形成包涵體，也有可能由于降解或?qū)?xì)胞的毒性作用使得表達(dá)水平極低 （45）。除了外界因素，包涵體的形成依賴于蛋白質(zhì)特異的折疊行為，而不是蛋白的通常特 性，如大小，融合標(biāo)簽，相對的疏水性。包涵體的形成是一個由許多蛋白質(zhì)參與的極端復(fù)雜的動力學(xué)過程，依賴于蛋白質(zhì)的折疊速率和聚集速率，并且與蛋白質(zhì)的合成和降解程度相關(guān)（35）。 包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性在過去幾十年的發(fā)展過程中，重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白提供了新的途徑，盡管有不同的宿主系統(tǒng)可供選擇，如果翻譯后修飾不是蛋白質(zhì)功能所必需的話，大腸桿菌和其它的原核宿主系統(tǒng)仍然是生產(chǎn)重組蛋白的首選(17)。相似的，親和相互作用還可以整合進其它的高通量處理，如親和膜過濾和親和沉淀（2）。雙水相萃取和擴張床吸附技術(shù)，可以處理全細(xì)胞培養(yǎng)液，通過整合技術(shù)的使用，能達(dá)到萃取、濃縮和初步純化的目的。對于包涵體蛋白質(zhì)，由于涉及包涵體蛋白質(zhì)的變復(fù)性，其純化步驟和方法與可 溶性蛋白不同，需要對每一種包涵體蛋白質(zhì)建立相應(yīng)的復(fù)性方法，將在后面作介紹。在初始的純化階段，除了使目標(biāo)蛋白和細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA、 多糖以及性質(zhì)差別較大的蛋白質(zhì)成分分離，采用的分離方法要能除去影響目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的雜質(zhì)，保護目標(biāo)蛋白不被蛋白酶降解，進行目標(biāo)蛋白的捕獲和濃縮。所以在分 離純化的開始階段，要盡可能的了解目標(biāo)蛋白的特性，不僅如此還要了解所存在雜質(zhì)成分的性質(zhì)，如大腸桿菌的蛋白大多是一些低分子量的蛋白（50000Da），而且酸性蛋白較多；3 在純化的早期階段要盡量減少處理的體積，方便后續(xù)的純化；4 在純化的后期階段，再使用造價高的純化方法，這是因為處理的量和雜質(zhì)的量都已減少，有利于昂貴純化材料的重復(fù)使用，減少再生的復(fù)雜性（84）。凝膠過濾層析用于后續(xù)的精制步驟，如去除 少量的雜蛋白或聚合體，在純化過程中用于脫鹽和緩沖液交換。 分離純化的方法策略及其應(yīng)用下 游的分離純化步驟不僅要在可替換的分離技術(shù)間進行選擇，如細(xì)胞的破碎可選擇高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎或酶溶法，分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、包涵體和沉淀 物，可選擇離心或過濾，需要進行濃縮的時候，可選擇沉淀或超濾；另一方面，設(shè)計的純化工藝包括特定的層析步驟，及層析的先后順序，以期得到最大的得率。1.Richard等在純化重組大腸桿菌RNA聚合酶σ32亞基的工作中給出了很好的范例，在定量測定項中，包括了蛋白質(zhì)的定量測定、定量SDSPAGE、定量蛋白質(zhì)斑點印跡和酶活測定，使用這些方法對操作的每一個階段取樣進行純化效果的評價，從而確保每一步純化的有效性（1）。另外當(dāng)一些蛋白沒有方便可用的生物學(xué)活性測定方法，或者由于干擾物質(zhì)的存在不能測活，可應(yīng)用一 些免疫學(xué)的方法進行檢測。在分離純化的每一步，都需要對蛋白和活性進行定量，這就要求分析方法有準(zhǔn)確可定量的特點，以對分離純化的效果進行評價?？焖賱t要求能很快的給出定性和定量結(jié)果，以便更好的與分離純化的工作相銜接。在理想的情況下，我們希望所選擇的分析方法具有特異、快速、靈敏和可定量的特點。在 進行任何純化工作時，第一步必須針對目標(biāo)蛋白建立特異性的分析方法。根據(jù)報導(dǎo)蛋白質(zhì)的ΔGf→u在5—20kcal/mol范圍之間，—2kcal/mol自由能的變化，—，因此ΔGf→u相對比較小，這樣天然狀態(tài)僅僅比去折疊狀態(tài)穩(wěn)定一點，所以必須克服蛋白質(zhì)內(nèi)在的不穩(wěn)定性，保留蛋白的活性。除了在分離純化的初期，要采用快速的方法除去影響目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的雜質(zhì)，還要嚴(yán)格控制涉及蛋白質(zhì)變性的各種因素，來避免蛋白質(zhì)失去活性。當(dāng)然對目標(biāo)蛋白純度的要求要根據(jù)純化蛋白的用途而定，對于治療性的蛋白要求有大于99%的純度，并對處方有活性和穩(wěn)定性的要求，對于某些酶的純度則要求較低，需要在純度和得率之間進行一個平衡，所以下游的工藝流程取決于最終對目標(biāo)蛋白的要求。在這樣一個混合體系中，蛋白質(zhì)純化要求將目標(biāo)蛋白與其它的成分分離，得到一定 的量，達(dá)到一定的純度，同時要盡可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。選擇將所表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外或周質(zhì)空間可以避免破碎細(xì)胞的步驟，并且由于蛋白質(zhì)種類少，目標(biāo)蛋白容易純化；而在 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)蛋白，可能是可溶性表達(dá)，可能形成包涵體，可溶性的蛋白往往需要復(fù)雜的純化步驟，而包涵體易于分離，純度較高，但回收具有生物活性的蛋白卻變 的相當(dāng)困難，需要對聚集的蛋白進行變復(fù)性，通常活性蛋白的得率比較低，表1列出了不同策略對表達(dá)、純化的影響，對于其中的有些缺點可以通過一定的方法進行克服和避免，如利用DNA重組技術(shù)給外源蛋白加上一個親和純化的標(biāo)簽，有助于可溶性外源蛋白的選擇性純化，并能保護目標(biāo)蛋白不被降解（96）。 概述分離純化組成了基因工程的下游處理（downstream processing） 階段，這一過程又和上游過程緊密相聯(lián)系，上游過程的諸方面影響到下游的分離純化，所以在進行目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)純化時要統(tǒng)一考慮和整體設(shè)計，并充分考慮上游因 素對下游的影響，如是否帶有親和標(biāo)簽，是否進行分泌表達(dá)。重組蛋白和多肽的分離純化1.目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)有三大類，分別是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和CHO細(xì) 胞表達(dá)系統(tǒng)，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法顯著影響下游的處理過程，目標(biāo)蛋白表達(dá)是否形成包涵體，目標(biāo)蛋白表達(dá)的定位（胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和胞外），蛋 白表達(dá)的量都依賴于所選擇的表達(dá)系統(tǒng)。表 1 重組蛋白不同表達(dá)策略的優(yōu)點和缺點表達(dá)策略優(yōu)點缺點分泌表達(dá)至細(xì)胞外增強正確二硫鍵的形成降低蛋白酶對表達(dá)蛋白的降解可獲得確定的N末端顯著減少雜蛋白水平，簡化純化不需要細(xì)胞破碎表達(dá)水平低多數(shù)蛋白不能進行分泌表達(dá)表達(dá)蛋白需要進行濃縮細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá)增強正確二硫鍵的形成可獲得確定的N末端顯著減少雜蛋白水平，簡化純化好些蛋白不能分泌進入周質(zhì)空間沒有大規(guī)模選擇性的釋放周質(zhì)空間蛋白的技術(shù)周質(zhì)蛋白酶可引起重組蛋白酶解胞內(nèi)包涵體表達(dá)包涵體易于分離保護蛋白質(zhì)不被降解蛋白質(zhì)不具有活性對宿主細(xì)胞生長沒有大的影響，通?？色@得高的表達(dá)水平需要體外的折疊和溶解，得率較低具有不確定N末端胞內(nèi)可溶性蛋白表達(dá)不需要體外溶解和折疊一般具有正確的結(jié)構(gòu)和功能高水平的表達(dá)常難以得到需要復(fù)雜的純化可發(fā)生蛋白質(zhì)的酶解具有不確定的N末端在 細(xì)胞的提取物中，除了目標(biāo)蛋白外，還含有其它各種性質(zhì)的蛋白、核酸、多糖等。所以蛋白質(zhì)的分離純化可以看作是一系列的分部收集過程，總是希望目標(biāo)蛋白富集 于其中的一個收集部位，而大量的雜蛋白存在于其它的收集部位。蛋 白質(zhì)的功能依賴于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對于有生物活性的蛋白質(zhì)，在分離純化過程中必須根據(jù)目標(biāo)蛋白的特點，采用合適的操作條件和方法，保證目標(biāo)蛋白的活性盡量不 損失。蛋白質(zhì)的構(gòu) 象穩(wěn)定性可以通過測定蛋白質(zhì)變性反應(yīng)時折疊（f）和去折疊（u）間自由能的變化（ΔGf→u）來衡量，ΔGf→u越大蛋白質(zhì)就越穩(wěn)定。這一點在分離純化和蛋白質(zhì)儲存中都很重要，影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素有溫度、pH、離子強度、某些添加劑、表面吸附、震搖、剪切力、凍融、蛋白濃度、壓力等，這些因素對折疊的影響有的是可逆的，有的是不可逆的，而且相互之間也有影響，在實際處理中應(yīng)選擇合適的條件，盡量避免不利因素的影響（2），并利用活性跟蹤的方法對處理進行評價，指導(dǎo)分離純化。這些特異性的分析方法都是基于目標(biāo)蛋白的一些特性，如酶的活性，免疫學(xué)活性，物理特性 （如分子量、等電點、光譜學(xué)特征等），生物學(xué)活性。特異性要求分析方法反 映目標(biāo)蛋白的獨特性，以排除假陽性。靈敏的分析方法僅需要少量的樣品，這就給 操作帶來了極大的方便。如通過SDSPAGE電泳測定蛋白質(zhì)分子量來鑒定蛋白質(zhì)，由于電泳的分辨率限制，常常不能確定收集部位中是否含有目標(biāo)蛋白或目標(biāo)蛋白是否得到了富集，這時就需要運用更特異的分析方法，如Western blotting就 可以從復(fù)雜的混合物中描述蛋白的分子量，并對蛋白進行定量。在純化的過程中，需要監(jiān)測以下幾個參數(shù)：總的樣品體積，樣品中總的蛋白，目標(biāo)蛋白的活性單位，通過這些基本的信息，就可以跟蹤每 步純化的效率，計算出目標(biāo)蛋白的回收率，目標(biāo)蛋白的比活性，以及純化的倍數(shù)，從而對純化的每一步，乃至整個流程進行定量評價。正是由于分析方法在分離純化中的指導(dǎo)性作用，所以有效的分析方法是分離純化是否能夠成功的前提。吸 附層析，如離子交換層析，疏水層析和親和層析，可基于特定的選擇性達(dá)到對目標(biāo)蛋白的純化，適用于大量樣品的處理。在分離純化中對每個步驟的選擇，可以遵循以下原則：1 應(yīng)盡可能的利用蛋白質(zhì)的不同物理特性選擇所用的分離純化技術(shù)，而不是利用相同的技術(shù)進行多次純化；2不 同的蛋白質(zhì)在性質(zhì)上有很大的不同，這是能從復(fù)雜的混合物中純化出目標(biāo)蛋白的依據(jù)，每一步純化步驟應(yīng)當(dāng)充分利用目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)成分物理性質(zhì)的差異。在下游的純化工藝中為了提高蛋白的得率和處理的效率，應(yīng)當(dāng)使用最少的純化步驟，經(jīng)典的純化過程如圖1 所示。在這 一階段的純化中，鹽析沉淀仍然應(yīng)用，但共沉淀的雜質(zhì)常常很多，離子交換層析和疏水層析具有操作上的優(yōu)點，可以再生使用，成為這一步通常選用的層析方法；中 間階段純化是最為關(guān)鍵的階段，這時要能達(dá)到和大量的雜蛋白分離，利用蛋白質(zhì)不同的性質(zhì)選擇不同的純化方法，每一步的方法要有足夠的選擇性，提高目標(biāo)蛋白質(zhì) 的純度；最后進行精制純化，常用凝膠層析，使目標(biāo)蛋白的純度進一步提高達(dá)到要求。圖1 經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化流程圖在工業(yè)上，為了盡可能提高過程的通量和減少生產(chǎn)的成本，發(fā)展的方法與傳統(tǒng)的方法不同。另外這兩種技術(shù)和親和相互作用結(jié)合可進一步提高處理的選擇性。生產(chǎn)上使用的非線性色譜，如置換色譜，一次層析的載量很大，得到的蛋白純度很高，近年來也有很大的發(fā)展和應(yīng)用（85,36）。細(xì)菌如大腸桿菌可以在短時間里得到高水平表達(dá)的蛋白質(zhì)，但同時表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成非活性的包涵體。 強的表達(dá)系統(tǒng)，高的誘導(dǎo)劑濃度，相對較高的培養(yǎng)溫度常常造成包涵體的形成。盡管如此，限制折疊速率的結(jié)構(gòu)特性，如二硫鍵的形成常常是含有二硫鍵蛋白質(zhì)正確折疊的限速步驟（并不絕對，因為有些 蛋白質(zhì)二硫鍵的破壞并不影響其功能），富含二硫鍵的蛋白質(zhì)具有更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，當(dāng)高水平表達(dá)時，由于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)是一個偏還原性的環(huán)境，蛋白質(zhì)容易形成 錯配的二硫鍵，這常常是包涵體形成的主要原因。蛋白質(zhì)的糖基化可以影響到蛋白質(zhì)的折疊行為和溶解性，當(dāng)它們在原核系統(tǒng)進行表達(dá)時，也容易聚集（4）?，F(xiàn)在發(fā)展了許多方法減少包涵體的形成，如使用中等強度或弱的啟動子，低溫培養(yǎng)，有限的誘導(dǎo)，優(yōu)化培養(yǎng)基條件，進行融合表達(dá)(49)，與伴侶分子和折疊酶共表達(dá)(3,5)，表達(dá)定位于不同的空間(7,58)，選擇突變的菌株（6,43）或其他的原核表達(dá)系統(tǒng)(34)。從 另一方面來講形成的包涵體易于和細(xì)胞的其它成分分離，而且過量表達(dá)的目標(biāo)蛋白在包涵體中得到了富集，提高了純度，降低了分離純化的難度。內(nèi)皮抑素 （endostatin）可以特異性的抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，具有抑制新生血管生成和抑制腫瘤生長的作用，已進入臨床研究階段。通過對內(nèi)皮抑素折疊機制的研究表明，緊密折疊的內(nèi)皮抑素對酸耐受，在酸性條件下有可能得到大量的正確折疊的蛋白質(zhì)（15）。在包涵體蛋白質(zhì)的變復(fù)性中，不管是采用什么方法進行折疊，都要用變性劑溶解包涵體，最終又都要去除變性劑，理解變性劑對蛋白質(zhì)的影響可以指導(dǎo)我們設(shè)計復(fù)性過程。如圖2所示，隨著變性劑濃度的變化，不僅具有天然構(gòu)象狀態(tài)蛋白質(zhì)的比率在改變，而且蛋白質(zhì)的溶解性也在改變。在低的變性劑濃度條件下，如圖2中a區(qū)段所示，天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的，但也會穩(wěn)定部分折疊的中間體，這些部分折疊的中間體易于自我締合形成沉淀。避免選擇c區(qū)段所在的條件進行折疊，因為這一區(qū)段天然和變性的蛋白質(zhì)都只有有限的溶解性，折疊速度也很慢（13）。在高的變性劑濃度，蛋白質(zhì)是去折疊的，充分溶劑化的，柔性的，在折疊緩沖溶液中，蛋白質(zhì)是折疊的，具有剛性的，將蛋白質(zhì)從高變性劑濃度條件變?yōu)檎郫B緩沖溶液，就會使蛋白質(zhì)坍塌形成緊湊的結(jié)構(gòu)，但蛋白的這一過程不總能有效進行，常常存在錯誤折疊和聚集，所以在包涵體的變復(fù)性過程中，除了要控制上面所講的參數(shù)，還有兩方面的參數(shù)需要控制，一是應(yīng)用添加劑，來促進折疊、減少聚集，二是控制溶液的氧化還原狀態(tài)促進二硫鍵的正確配對。前兩個步驟效率較高，但是再折疊的效率率常常不能令人滿意，折疊的方法和折疊的條件需要通過實驗來進行篩選。早在上世紀(jì)30年代，我國生化界先驅(qū)吳憲教授就對蛋白質(zhì)的變性作用進行了闡釋（8），30年后，Anfinsen通過對核糖核酸酶A的經(jīng)典研究表明去折疊的蛋白質(zhì)在體外可以自發(fā)的進行再折疊，僅僅是序列本身已經(jīng)包括了蛋白質(zhì)正確折疊的所有信息（9,10），并提出蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)假說，為此Anfinsen獲得1972年諾貝爾化學(xué)獎。盡管蛋白質(zhì)的氨基酸序列在蛋白質(zhì)的正確折疊中起著核心的作用，各種各樣的因素，包括信號序列，輔助因子，分子伴 侶，環(huán)境條件，均會影響蛋白質(zhì)的折疊，新生蛋白質(zhì)折疊并組裝成有功能的蛋白質(zhì)，并非都是自發(fā)的，在多數(shù)情況下是需要其它蛋白質(zhì)的幫助，已經(jīng)鑒定了許多參與 蛋白質(zhì)折疊的折疊酶和分子伴侶（3,16,86）， 蛋白質(zhì)“自發(fā)折疊”的經(jīng)典概念發(fā)生了轉(zhuǎn)變和更新，但這并不與折疊的熱力學(xué)假說相矛盾，而是在動力學(xué)上完善了熱力學(xué)觀點。在折疊的機制研究上早期的理論認(rèn)為，折疊是從變性狀態(tài)通過中間狀態(tài)到天然狀態(tài)的一個逐步的過程，并對折疊中間體進行了深入研究，認(rèn)為