基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)、純化和分析-展示頁
2025-01-13 17:38本頁面
【正文】 或過夜 。 五． 操作步驟 1. 挑取含 pUC18質(zhì)粒工程菌及含 pGFPuv質(zhì)粒工程菌單菌落，分別接種于含氨芐青霉（終濃度為 100μg/mL， 以下同 )的 5mL的LB培養(yǎng)基中，于 37℃ 、 250rpm過夜培養(yǎng)12h14h至對數(shù)生長期。 ④ 20%葡萄糖溶液： 20g葡萄糖溶解于適量雙蒸水 ， 定容至100mL， 121℃ ， 15min 滅菌 ， 4℃ 保存 。 ② 氨芐青霉素溶液： 無菌雙蒸水配成 100mg/mL， 分裝 ， 20℃ 保存 ， 使用終濃度為 50μg/mL或 100μg/mL。 2. 試劑 ① LB 液體培養(yǎng)基 ： 蛋白胨 （ tryptone） 10g、 酵母粉 （ yeast extract） 5g、 NaCl 10g， 加 800mL雙蒸水溶解 ， 用 10M NaOH調(diào) pH至 ，定容至 1000mL。 The structure of lac operon 調(diào)節(jié)序列 結(jié)構(gòu)基因 Repressor and negative regulation 異乳糖 異丙基硫代半乳糖苷 異乳糖 CAP and positive regulation 低乳糖時 高乳糖時 在協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)下， lac operon的強(qiáng)誘導(dǎo)作用發(fā)生在高乳糖、低葡萄糖的狀態(tài)。 只有在 CAP存在且沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合時 ， 或者說只有高乳糖低葡萄糖時 ，操縱子發(fā)揮最大轉(zhuǎn)錄活性 。 葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性 ，并活化磷酸二酯酶的活性 ， 從而降低 cAMP的濃度 ， 抑制轉(zhuǎn)錄 。 CAP分子內(nèi)分別有 DNA結(jié)合區(qū)和 cAMP結(jié)合區(qū) 。只有當(dāng)葡萄糖耗盡后，細(xì)菌才能充分利用乳糖，這種現(xiàn)象稱葡萄糖效應(yīng)，其實質(zhì)是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又稱降解物阻遏（ catabolic repression）。 然而 ， 誘導(dǎo)表達(dá)常常受到溫度和誘導(dǎo)物的影響 。 ? 乳糖操縱子的誘導(dǎo)表達(dá)（續(xù)） ?本實驗所使用的表達(dá)載體上含有乳糖操縱子的調(diào)節(jié)序列 ， 目的基因為綠色熒光蛋白基因 。 IPTG是異乳糖的結(jié)構(gòu)類似物 。 也就是說 ， 當(dāng)有乳糖存在時 ， 乳糖操縱子被誘導(dǎo) 。 也就是說 ， 當(dāng)沒有乳糖存在時 ， 乳糖操縱子處于阻礙狀態(tài) 。 ? 乳糖操縱子的誘導(dǎo)表達(dá) ?當(dāng)沒有乳糖存在時 ， 調(diào)節(jié)基因 lacI表達(dá) ， 轉(zhuǎn)錄的 mRNA翻譯成阻遏蛋白 。通常由 2個以上功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因以及一些調(diào)節(jié)序列（如啟動子序列、操縱序列等）組成。 ? 了解降解物阻遏的現(xiàn)象及其機(jī)理 。如多聚 His標(biāo)簽－ 6 His，便于鎳柱親和層析純化?；蚬こ痰南掠渭夹g(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 重組蛋白的表達(dá) 表達(dá)體系： 表達(dá)載體 原核 受體細(xì)胞 真核 選擇表達(dá)載體常用的關(guān)鍵元件： 啟動子和調(diào)節(jié)序列（表達(dá)強(qiáng)弱、細(xì)胞或組織特異性、表達(dá)調(diào)節(jié)等，如本實驗的乳糖操縱子。） 融合基因（純化、標(biāo)簽，或增強(qiáng)蛋白可溶性等。 GST融合蛋白用 GST柱親和層析） 分泌信號 篩選標(biāo)記 其它 6 His 重組蛋白的純化 親和層析 離子交換層析 凝膠過濾層析 …… 本單元實驗流程： 細(xì)菌（ pEFGFPuv） 親和層析 IPTG誘導(dǎo) 細(xì)菌總蛋白 重組蛋白融合蛋白 乳糖操縱子的特性 SDSPAGE 初步分析 實驗十 重組 DNA在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 一． 實驗?zāi)康? 二． 實驗原理 三． 材料與試劑 四． 實驗儀器 五． 操作步驟 六． 注意事項 七． 實驗安排 八． 思考與討論 一． 實驗?zāi)康? ? 了解和掌握 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的原理 。 二． 實驗原理 ? 操縱子是基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位。 ? 乳糖操縱子由三個結(jié)構(gòu)基因 Z、 Y、 A和操縱序列 、 啟動子 、 CAP結(jié)合位點等調(diào)節(jié)序列組成 。 阻遏蛋白與操縱序列 lacO結(jié)合 ， 阻礙了結(jié)合在旁邊啟動子的RNA聚合酶向前移動 ， 使結(jié)構(gòu)基因不能轉(zhuǎn)錄 ，也就不能翻譯出蛋白質(zhì) 。 ? 乳糖操縱子的誘導(dǎo)表達(dá)（續(xù)） ?當(dāng)有乳糖存在時 ， 乳糖轉(zhuǎn)化為異乳糖 ， 異乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合 ， 使阻遏蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變 ， 而不能結(jié)合到操縱序列上 ，RNA聚合酶可以從啟動子向 3’端移動 ， 于是 ，結(jié)構(gòu)基因可以轉(zhuǎn)錄出 mRNA， 然后翻譯出蛋白質(zhì) 。 ? 乳糖操縱子的誘導(dǎo)物是異乳糖 。 由于 IPTG不會被分解 ，它的誘導(dǎo)作用是持久的 。在 IPTG的誘導(dǎo)下 ， 目的基因表達(dá)可增強(qiáng) 105倍 。 ?乳糖操縱子的降解物 阻遏 ?當(dāng)細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中生長時，通常優(yōu)先利用葡萄糖，而不利用乳糖。 ?乳糖操縱子的降解物 阻遏（續(xù)） ?降解物 阻遏的機(jī)理：代謝物基因激活蛋白（ Catabolite gene Activation Protein，CAP），又稱 cAMP受體蛋白（ cAMP Receptor Protein， CR
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