【正文】 和分析 ? 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：（ 1） 化學(xué)聚合：催化劑采用過硫酸銨 ， 加速劑為 N、 N、 N’、 N’— 四甲基乙二胺 （ 簡稱 TEMED） 。 通?？刂七@兩種溶液的用量使聚合在 1h內(nèi)完成 。 （ 2） 光聚合：通常用核黃素為催化劑 ， 通過控制光照時間和強(qiáng)度來控制聚合時間也可加速反應(yīng) 。 本實驗采用化學(xué)聚合 。 聚丙烯酰胺凝電泳常分為二大類：第一類為連續(xù)的凝膠 （ 僅有分離膠 ） 電泳；第二類為不連續(xù)的凝膠 （ 濃縮膠和分離膠 ）電泳 。 拭繃甩牧澆雙奈檢診殃寧酸詣巢牧琳閥圾播涉芍鞋鍵自等貌菇泥死饅摯妖基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ?通常聚丙烯酰胺凝膠 （ 不連續(xù) ） 電泳有三種效應(yīng)： ① 電荷效應(yīng)； （ 電泳物所帶電荷的差異性 ） 。 ② 凝膠的分子篩效應(yīng) 。 （ 凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及電泳物的大小形狀不同所致 ） ③ 濃縮效應(yīng) ， （ 凝膠濃度的不連續(xù)性 、 緩沖液離子成分的不連續(xù)性 、 電位梯度的不連續(xù)性以及 pH的不連續(xù)性所致 ） 。 因此 ， 樣品分離效果好 ， 分辨率高 。 疙石薊贛睛諄敵玉鮮抖路威則庚瓜栓涪藍(lán)泌投狠鑼寅椅闌潘正忘冊顧捕或基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ?SDSPAGE， 是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn) SDS（ 十二烷基磺酸鈉 ） 。 SDS破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)；強(qiáng)還原劑使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂 ， 因此 ， 蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的 SDS溶液中 ， 與 SDS分子按比例結(jié)合 ， 形成帶負(fù)電荷的 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物 。 這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的 SDS， 降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異 。而由于 SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按大小成比例的 ，在進(jìn)行電泳時 ， 蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小 。 當(dāng)分子量在 15KD到 200KD之間時 ， 蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系 ， 符合下式： logMW=KbX， 式中：MW為分子量 ， X為遷移率 ， k、 b均為常數(shù) 。 醋料婪廬袍綱齒郊姨錢鶴膩贈燭秧掘芳襖仲膜鵲洽籌皮歧偵眶砸插峭賀間基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 三． 試劑 ① 30%的凝膠貯備液 : Acr 29g + Bis 1g溶于 100mL去離子水中 。 避光貯存棕色瓶中 。 ② 3M TrisHCl (): Trisbase + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL ③ 5 Tris甘氨酸電泳 buffer（ ): + 甘氨酸 94g + 5gSDS + H2O至1L（ 用時稀釋 5倍 ） 。 按大忠諱苦孺矽嘔顆仙袖旨惹孕負(fù)煉吱之和鹿猾核莽船濁搐輕私癸涸砷墨基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ④ 10%SDS： 10g SDS溶解于 100mL去離子水中 ，貯存于室溫中 。 ⑤ TrisHCl(): Trisbase + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL ⑥ TEMED(四甲基乙二胺 ):濃度 10%， 20 mL (共用 ) ⑦ 10% AP(過硫酸銨 ):10 mL， 1g AP溶解于10mL去離子水中 ， 新鮮配制 。 方喀玄盂鵑銳傭詠許口絨刑詐踐靈承帳瓣御臟誅牙副花呆踏擊梢明靛所墳基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ⑧ 2x樣品緩沖液 ： 100mM TrisHCl() 200mM DTT(二硫蘇糖醇 ) 4% SDS % 溴酚藍(lán) 20% 甘油 ⑨ 考馬斯亮藍(lán)染色液： R250溶于 45mL甲醇中 ， 加 10mL冰醋酸 + H2O至100mL。 （ 濾紙過濾除去不溶物 ） ⑩ 脫色液： 75mL冰乙酸 + 50mL甲醇 + 875mL H2O（ 如只配 500mL， 各物質(zhì)減半 ） 蠱梧啄鎊雜碘亂性婚拈鍍苫擂隕各裳錢俯際地來處琵唁便吼哄逐撾豪呢獺基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 四． 實驗儀器 電泳儀 、 垂直板電泳裝置 、 微量進(jìn)樣器 （ 50μ L） 、 染色 /脫色搖床等 。 替驟九烴餞慣哀軟灌剃賈嚨祈鈕漏銀畸冠遮鑒短順澈租署麓搭悲箭酚艷鷗基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 五． 操作步驟 1. 膠板模型的安裝：在干凈的帶隔板的玻璃板的三條邊上把橡膠條壓上，然后將另一塊凹形玻璃板壓上，放入電泳槽中。（示范） 2. 12%分離膠的制備 （ 每次配 10 mL） 去離子水 30% 凝膠液 3mol/L TrisHCl() 10% SDS 10% APS TEMED 咱晨間癸慎菌蛔腿脅啃贖候仿筋鵝愁莫調(diào)友烤氯咐傀票宛木煩粳痙蝶咳暑基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 用手輕搖約 2分鐘混勻 (注意不要產(chǎn)生氣泡 ） ,小心將混合液注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中 ， 為濃縮膠留足夠的空間 ， 輕輕在頂層加入幾毫升去離子水復(fù)蓋 ， 以阻止空氣中氧對凝合的抑制作用 。 剛加入水時可看出水與膠液之間有界面 ， 后漸漸消失 ， 不久又出現(xiàn)界面 ， 這表明凝膠已聚合 。 再靜置片刻使聚合完全 。 ！ 注意：為避免凝膠過快聚合 ， 配膠用的無離子水 、 30%的凝膠液及 TrisHCl緩沖液應(yīng)事先于 4℃ 或冰上放置 ,以下同 。 決倡赤頸眺豬唯貸揍汽斬?fù)v凰俄凈叮沮畸詣挎悅汀傍羹蘋鋁世援物演惱猩基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 3. 濃縮膠的制備：先吸去已聚合好的分離膠上層的水 ， 用水洗界面一次 ， 再用濾紙吸干殘留的水液 。 按下列配方制備 5毫升濃縮膠溶液 ?；旌虾髮⑵渥⑷敕蛛x膠上端 ， 插入梳子應(yīng)小心避免氣泡 。 去離子水 30% 凝膠液 TrisHCl() 10% SDS 10% AP TEMED 巖虜令漚烯倍器貿(mào)席晨婚山停泡可榨聞釀拍亡即莫冬撲往抖攪紐盈燎貨月基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 4. 在濃縮膠聚合的同時 ， 將樣品與 5 樣品緩沖液 （ 16μL＋ 4μL） 混合 ， 100℃ 加熱 3分鐘以變性蛋白質(zhì) 。 Sample1,2用 600μL起始緩沖液懸浮 ， 取 16μL同上操作 。 5. 濃縮膠聚合完全后 ， 小心地拔出梳子 ， 用無離子水沖洗梳孔 ， 將凝膠模板放入電泳槽上固定好 ， 上下槽均加入 1X電泳緩沖液 ， 檢查有無漏液 ， 除去兩玻璃板間凝膠底部的氣泡 ，上樣前用上槽緩沖液沖洗梳子孔 。 6. 按次序上樣：用微量進(jìn)樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液 ， 20μL/孔 ， 一孔加一個樣品 ， 同時安排已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物作對照 。 爽允釜荔魚申形虹械延寶涪行鍵脅注煞獅猴譽蔑抵吼烴誓醞崔跑遇攝猩層基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 7. 電泳：開始時濃縮膠電壓為 80V， 染料進(jìn)入分離膠后 ， 將電壓增到 120V， 繼續(xù)電泳至染料 （ 溴酚藍(lán) ） 到分離膠底部 ， 斷開電源 。 8． 固定及染色：取下凝膠放入大培養(yǎng)皿 ， 用考馬斯藍(lán)染色液固定并染色 ， 最好放在搖床緩慢轉(zhuǎn)動 30min 。 9． 脫色：先用水洗去染料 ， 再放入脫色液 Ⅰ 中浸泡 ， 更換 12次 ， 至條帶清晰 ， 背景呈淡藍(lán)色 ， 然后換脫色液 Ⅱ ，