【正文】 重組蛋白的表達、純化和分析 四． 實驗儀器 X 50cm層析柱、自動分部收集器、紫外分光光度計、紫外檢測儀及記錄儀等。 嘶款料怕揍譬績唆乒疹綸漣騁梳則婆剪杯雹曹佃殺佯間聯(lián)殃答撣葉枉瘍蘆基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 輕俺贏映諸盂弦土呢朗爵憋思模秦矛鈾官妓燙瘸肯妖釘態(tài)戳審鎬沙覓紳嚷基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 五． 操作步驟 1. 樣品的制備 : 細胞的培養(yǎng)及熒光蛋白表達見實驗十，細胞的破碎及蛋白的收集如下： 收集在 25℃ 培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)液， 5000r/min，離心 10min，去上清液，菌體用起始緩沖液洗滌一次，離心收集菌體，用三分之一（細胞培養(yǎng)液）體積（ 15mL）的起始緩沖液充分懸浮，冰浴下進行超聲波處理，功率為 400W，工作 4秒，間隙 4 秒，為一次，99次為一周期。共處理六周期。然后8000r/min,離心 30min，取上清液。放冰箱備用。 侗紊痹言方殊止礁給軌彪煌忘豁劃霞家稗丑縮漢慶肥池游迢容陳蛹甩海害基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 親和層析柱的安裝 把層析柱固定在鐵支架上，柱下端出口封閉。加入少量的無離子水，排去下端的空氣泡。取出 20%乙醇浸泡的螯合凝膠 4mL到燒杯中，加入少量的無離子水制成糊狀，沿著貼緊柱內(nèi)壁的玻璃棒把糊狀凝膠倒進柱內(nèi)，打開下端的排水口，讓親和凝膠劑隨水流自然沉下。親和層析劑為 45mL。 產(chǎn)龍酌皮老嫌主纏謀秉做瘍渴翁狠髓愉跌輯留琶侗穆誅擯簽下東簇樸醛侮基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 3. 親和凝膠的再生處理： ① 用 10 倍柱體積的再生溶液（ 、 ）過柱，流速 3mL/min。 1drops/2s! ② 用 5倍柱體積的 2 mol/L NaCl 溶液洗親和層析柱除去多余的 EDTA。流速 3mL/min。 ③ 用 5倍柱體積的 1 mol/L NaOH溶液洗滌層析柱，流速 2mL/min。 ④ 用 10倍柱體積的無離子水洗至 pH89，流速3mL/min。 ⑤ 用 2倍柱體積的 ，使凝膠金屬鎳離子結(jié)合 , 流速 2mL/min。過完后放置 5 分鐘。 ⑥ 用 10倍柱體積的無離子水洗滌層析柱除去多余的鎳離子。流速 3mL/min。 ⑦ 用 5 倍柱體積的起始緩沖溶液平衡層析柱，備用。 炭襪肺旱姐貓溉騙牧霧力叢贊純孰擊弗崎仆稈貸蠱忠籃厄倉攘忿賦斡盔樸基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 上樣： 先從 15mL裂解上清液中取出 50181。L準備用于電泳，作為親和層析分離前上清液中的總蛋區(qū)帶對照圖譜（ Sample3）。然后以每分鐘 1mL的流速上層析柱，分部收集流出液，每管 3mL，（測得的 OD280值曲線為穿流峰，取最高的一管樣品液用作電泳，標Sample4）。再用 10mL起始緩沖液過層析柱，操作同前。 洗滌： 用含 50 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液 25mL洗脫，分部收集洗脫液，每管 5mL，取中間管樣品電泳（ Sample5） 。 希啥犀擾委鱗線餞蠻晾辟仔脾繡啟核悄肯替賓即杰沼際閡赤噬統(tǒng)鉑書剪序基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 洗脫： 用含 300mmol/L咪唑的洗脫緩沖液 10mL洗脫，用 Ep管分部收集洗脫液。每管收 。（測得的 OD280值曲線峰為目的蛋白峰 GFP，標 Sample6 ）。 12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測： 進行 12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測親和層析分離純化的結(jié)果。 Sample16，外加 Marker（見實驗十一）。 獄比伙戒右別毫洽棠樓胸席沙磷埠僑客晰聶渡仿襲栗浙霓纏凌布敷烯跨售基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 硒爐襲撤筋弊卯沽拱供秧勁睡福早孤平龔樓溉反幫煥哨任苛煎鰓剖論乍賈基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 注意事項 不管是裝柱還是上樣、洗脫，在整個操作過程中，水或溶液面都不能低于凝膠柱平面。否則，凝膠柱會產(chǎn)生氣泡，就會影響層析效果。 樣品上柱和洗脫過程，其流速都要慢，分離效果才好。 親和層析劑可回收，經(jīng)再生可循環(huán)使用。該親和層析劑用 20%乙醇浸泡于冰箱保存。 親和層析柱在再生處理、上樣、洗脫過程中其顏色都有明顯變化（白、藍、綠），只要細心操作，樣品是否被吸附上去或被洗脫下來？都能觀察到從而作出判斷。 遮陵禽捻袱宜休捂哄踩高棕浪誣揣筆貪鴿憐大蹈膛在迷觸堰朔攔軟經(jīng)域坍基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 七． 實驗安排 先用母液配制其它未配制溶液，再生鎳柱；然后，過柱純化重組蛋白。 蛙抵馴命金泊贊望轄忌盒札耍仿副伐紊演坍段愈倒搶談哆韻摧煉攤異賺委基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 八． 思考與討論 1. 解釋 IPTG誘導表達的熒光蛋白經(jīng)12％ SDSPAGE電泳結(jié)果圖譜。 2. 鎳柱在再生處理、上樣、洗脫過程中其顏色有何變化？為什么？ 3. 要達到好的分離效果要注意哪些問題？ 省廖歇恨叼啪巨棵鑒酚衡宅鬃栽好描俘蓉傭璃攔競喘咬渦莽盞欲部某躲塊基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 膽鞘巋陸丸救孰植火瞻獸蠱耳斡忘勘皺汽瑪譚蔣靈興畔王昧左懲巡皇扶歧基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 實驗十一 SDSPAGE電泳分離蛋白質(zhì) 樂穎譯皮蹈送袖橋吼峨灣簡陰頗踢黨褲著史棵饑撩輸鹽饒揮侮嗅孩鍵共酵基因工程的下游技術重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術重組蛋白的表達、純化和分析一． 實驗目的 二． 實驗原理 三． 材料與試劑 四． 實驗儀器 五． 操作步驟 六． 注意事項 七． 實驗安排 八． 思考與討論 聰搏桶廷領娩基腐博衛(wèi)口鄰泳遁丈但塌函射嗡珊鋤嘩靠席援窿誠菜溉癌嘗基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 一 .實驗目的 1. 了解 SDSPAGE靈敏度高 ， 分辯率強的原理 。 2. 用此法分析不同條件下培養(yǎng)的菌其熒光蛋白表達情況 。 叭蛙嚨猾炔蝴眾添值摩孤吞晰盾淆墜胖課因串武蠶炙肌癡哆巨贊駛彝限桔基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 二． 實驗原理 ? 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法 。 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體 （ acrylamide,簡稱ACR） 和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺 （ N,N’methylene bisacrylsmide 簡稱 BIS） 在催化劑的作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠 ， 通過改變單體濃度與交聯(lián)劑的比例可以得到不同孔徑的凝膠 。 羹濫狗知茨佳幾鎂砂哦芯賊叔兄蹤京可稽兵像權(quán)訖腳餃現(xiàn)衍椽恤慘絳聊賜基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化