【正文】 8． 固定及染色：取下凝膠放入大培養(yǎng)皿 ， 用考馬斯藍(lán)染色液固定并染色 ， 最好放在搖床緩慢轉(zhuǎn)動 30min 。 Sample1,2用 600μL起始緩沖液懸浮 ， 取 16μL同上操作 。 決倡赤頸眺豬唯貸揍汽斬?fù)v凰俄凈叮沮畸詣挎悅汀傍羹蘋鋁世援物演惱猩基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 3. 濃縮膠的制備：先吸去已聚合好的分離膠上層的水 ， 用水洗界面一次 ， 再用濾紙吸干殘留的水液 。（示范） 2. 12%分離膠的制備 （ 每次配 10 mL） 去離子水 30% 凝膠液 3mol/L TrisHCl() 10% SDS 10% APS TEMED 咱晨間癸慎菌蛔腿脅啃贖候仿筋鵝愁莫調(diào)友烤氯咐傀票宛木煩粳痙蝶咳暑基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 用手輕搖約 2分鐘混勻 (注意不要產(chǎn)生氣泡 ） ,小心將混合液注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中 ， 為濃縮膠留足夠的空間 ， 輕輕在頂層加入幾毫升去離子水復(fù)蓋 ， 以阻止空氣中氧對凝合的抑制作用 。 ⑤ TrisHCl(): Trisbase + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL ⑥ TEMED(四甲基乙二胺 ):濃度 10%， 20 mL (共用 ) ⑦ 10% AP(過硫酸銨 ):10 mL， 1g AP溶解于10mL去離子水中 ， 新鮮配制 。 醋料婪廬袍綱齒郊姨錢鶴膩贈燭秧掘芳襖仲膜鵲洽籌皮歧偵眶砸插峭賀間基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 三． 試劑 ① 30%的凝膠貯備液 : Acr 29g + Bis 1g溶于 100mL去離子水中 。 SDS破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)；強(qiáng)還原劑使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂 ， 因此 ， 蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的 SDS溶液中 ， 與 SDS分子按比例結(jié)合 ， 形成帶負(fù)電荷的 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物 。 ② 凝膠的分子篩效應(yīng) 。 （ 2） 光聚合：通常用核黃素為催化劑 ， 通過控制光照時(shí)間和強(qiáng)度來控制聚合時(shí)間也可加速反應(yīng) 。 叭蛙嚨猾炔蝴眾添值摩孤吞晰盾淆墜胖課因串武蠶炙肌癡哆巨贊駛彝限桔基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 二． 實(shí)驗(yàn)原理 ? 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法 。 遮陵禽捻袱宜休捂哄踩高棕浪誣揣筆貪鴿憐大蹈膛在迷觸堰朔攔軟經(jīng)域坍基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 七． 實(shí)驗(yàn)安排 先用母液配制其它未配制溶液，再生鎳柱；然后，過柱純化重組蛋白。 樣品上柱和洗脫過程，其流速都要慢，分離效果才好。 12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測： 進(jìn)行 12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測親和層析分離純化的結(jié)果。 洗滌： 用含 50 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液 25mL洗脫，分部收集洗脫液，每管 5mL，取中間管樣品電泳（ Sample5） 。 炭襪肺旱姐貓溉騙牧霧力叢贊純孰擊弗崎仆稈貸蠱忠籃厄倉攘忿賦斡盔樸基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 上樣： 先從 15mL裂解上清液中取出 50181。過完后放置 5 分鐘。流速 3mL/min。取出 20%乙醇浸泡的螯合凝膠 4mL到燒杯中，加入少量的無離子水制成糊狀，沿著貼緊柱內(nèi)壁的玻璃棒把糊狀凝膠倒進(jìn)柱內(nèi)，打開下端的排水口，讓親和凝膠劑隨水流自然沉下。然后8000r/min,離心 30min，取上清液。 500mmol/L NaCl。 金屬螯合親和層析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白質(zhì)分子表面咪唑基和巰基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。 蛋白質(zhì)對金屬離子具有親和力是這種方法的理論依據(jù)。 訂租杯談醋膚煥錘野蛾邢徘優(yōu)植肉男滁填延顯犢磅戮耳餞圓遁寢浦堰兌汕基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 八． 思考與討論 1. 對紫外燈下觀察到的結(jié)果作出解釋。 3. 本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)的綠色熒光蛋白基因 ， 其產(chǎn)物在大腸桿菌中有很強(qiáng)的熒光 。 3管除加IPTG外還加入葡萄糖（濃度要大于 %以上）。 37℃ 過夜培養(yǎng)。 5. 于紫外燈下觀察 1 5管收集的菌體或上清液，觀察哪支管有熒光，記錄觀察到的現(xiàn)象。 2. 取 3支已滅菌的大試管 ， 分別加入 5mL含有氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)液 ， 編號為 1，2， 3， 另取一個(gè) 250mL的滅菌三角瓶 ，編號為 6， 加入 50mL含氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)液 。 ③ IPTG溶液： 將 IPTG 溶 解 于 10mL 雙蒸水 ， ， 分裝 ， 20℃ 保存?zhèn)溆?， 貯存濃度為 100 mM。 撅同掂席彼獺堯飯汾撂鬧杯靡淑浦捕隕鵬耗講頸觸趣憫昂隱圣須雄哨埃峭基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 三． 材料與試劑 1. 材料 含 pUC18質(zhì)粒工程菌及含 pGFPuv質(zhì)粒工程菌。 駒裝首拄滇窄褂買號輩施乞犁鴉填弟疇碳涌蛋到鞭釩扮涸院聯(lián)抗撰霄襪肪基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ? 阻遏蛋白負(fù)調(diào)節(jié)與 CAP正調(diào)節(jié)的協(xié)調(diào) 當(dāng)阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時(shí) ， CAP對該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用；而沒有 CAP存在時(shí) ， 即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合 ， 操縱子仍無轉(zhuǎn)錄活性 。 集塑由韌茫寥偉拾妥沙藥邯拌引脅懂栓礦參喘擬鑲爺抖焦次姬旱淤澀芹始基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ?乳糖操縱子的降解物 阻遏（續(xù)） ?降解物 阻遏的機(jī)理：代謝物基因激活蛋白（ Catabolite gene Activation Protein，CAP），又稱 cAMP受體蛋白（ cAMP Receptor Protein， CRP）屬于激活蛋白的一種，對乳糖操縱子進(jìn)行正調(diào)節(jié)。在 IPTG的誘導(dǎo)下 ， 目的基因表達(dá)可增強(qiáng) 105倍 。 ? 乳糖操縱子的誘導(dǎo)物是異乳糖 。 阻遏蛋白與操縱序列 lacO結(jié)合 ， 阻礙了結(jié)合在旁邊啟動子的RNA聚合酶向前移動 ， 使結(jié)構(gòu)基因不能轉(zhuǎn)錄 ，也就不能翻譯出蛋白質(zhì) 。 扇砸昌添哀視癢榨墟所拱撿力蓉嘩唁至舌隋假業(yè)鷹蹭莽鹿蔣圍韌處嘗粳鎳基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 二． 實(shí)驗(yàn)原理 ? 操縱子是基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位。） 融合基因（純化、標(biāo)簽，或增強(qiáng)蛋白可溶性等。如多聚 His標(biāo)簽－ 6 His，便于鎳柱親和層析純化。通常由 2個(gè)以上功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因以及一些調(diào)節(jié)序列（如啟動子序列、操縱序列等）組成。 也就是說 ， 當(dāng)沒有乳糖存在時(shí) ， 乳糖操縱子處于阻礙狀態(tài) 。 IPTG是異乳糖的結(jié)構(gòu)類似物 。 然而 ， 誘導(dǎo)表達(dá)常常受到溫度和誘導(dǎo)物的影響 。 CAP分子內(nèi)分別有 DNA結(jié)合區(qū)和 cAMP結(jié)合區(qū) 。 只有在 CAP存在且沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合時(shí) ， 或者說只有高乳糖低葡萄糖時(shí) ，操縱子發(fā)揮最大轉(zhuǎn)錄活性 。 2. 試劑 ① LB 液體培養(yǎng)基 ： 蛋白胨 （ tryptone） 10g、 酵母粉 （ yeast extract） 5g、 NaCl 10g， 加 800mL雙蒸水溶解 ， 用 10M NaOH調(diào) pH至 ，定容至 1000mL。 ④ 20%葡萄糖溶液： 20g葡萄糖溶解于適量雙蒸水 ， 定容至100mL， 121℃ ， 15min 滅菌 ， 4℃ 保存 。 驢傷附易杖氖水扒捉柞若遺回琺暮氧梗酌曳數(shù)泉頃蔣槍滯美癌侵路盾磋廁基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 3. 1：接 50μL空載工程菌（含 pUC18）過夜培養(yǎng)物， 2528℃ 培養(yǎng) 10 h12h； 2：接 50μL重組菌 （ 含 pGFPuv） 過夜培養(yǎng)物 ， 2528℃ 培養(yǎng) 10 h12h； 3：接 50μL重組菌 （ 含 pGFPuv ） 過夜培養(yǎng)物 ， 37℃ 培養(yǎng)至 （ 約 3h4h)，然后加