利用基因工程技術(shù)表達(dá)蛋白質(zhì)-資料下載頁
2024-09-20 20:40本頁面
【正文】 PPL Therapeutics Preclinical 外傷和手術(shù)時(shí)作組織膠粘劑 胰高血素樣肽 1 PPL Therapeutics Ramp。D II型糖尿病 人 GH Genzyme Transgenics Ramp。D 身體生長發(fā)育，脂肪動(dòng)員 HAS Genzyme Transgenics Ramp。D 血漿膨脹劑和藥物賦形劑 MSP1 (瘧疾苗 ) Genzyme Transgenics Ramp。D 瘧疾 蛋白 C PPL Therapeutics Preclinical 防止深部靜脈的血栓形成 降鈣素 (salmon) PLL Therapeutics Preclinical 骨質(zhì)疏松 tPA Genzyme Transgenics Ramp。D 心肌梗塞和非栓塞 （三）提高真核表達(dá)效率的技術(shù)方法 1. 選用強(qiáng)啟動(dòng)子，如 CMV、 EF1α 等； 2. 組成型表達(dá)（可誘導(dǎo)表達(dá)）； 3. 增強(qiáng)子，如 MAR序列； 4. poly(A)； 5. Dhfr加壓篩選系統(tǒng)； 6. 串聯(lián)表達(dá)； 7. 穩(wěn)定表達(dá)（瞬時(shí)表達(dá)）； 8. Kozak序列。 基因組序列的選擇性擴(kuò)增 — 染色體擴(kuò)增 以 dhfr基因的擴(kuò)增為例，說明基因組序列的選擇性擴(kuò)增機(jī)制。 二氫喋啶 FH2 FH4 CoF衍生物 合成嘌呤或嘧啶 注： （ 1） 合成酶； （ 2） 還原酶。 （ 1） （ 2） 染色體擴(kuò)增的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)特定基因拷貝數(shù)的專一性大量擴(kuò)增 (amplification)。 （ Amplification refers to the production of additional copies of a chromosomal sequence, found as intrachromosomal or extrachromosomal DNA. ） 葉 酸 四氫葉酸 Mammalian genes for DHFR(dihydrofolate reductase) have the same relative anization of rather short exons and very long introns, but vary extensively in the lengths of corresponding introns. 1. 類型： Unstable lines and Stable lines In unstable lines, the amplified genes are at least partially lost when the selective pressure is released, because the amplified genes exist as an extrachromosomal array. In stable lines, the amplified genes are retained, because they reside on the chromosome, at the site usually occupied by the single dhfr gene. Usually the other chromosome retains its normal single copy of dhfr. Figure The dhfr gene can be amplified to give unstable copies that are extrachromosomal (double minutes) or stable (chromosomal). Extrachromosomal copies arise at early times. A. 在用 MTX加壓篩選的初期，細(xì)胞大部分或全部是不穩(wěn)定的； B. dhfr基因的單細(xì)胞拷貝數(shù)的變化范圍為 40~400，隨著加壓程度的提高，拷貝數(shù)逐漸增加（可達(dá) 1000個(gè)），對 MTX的耐受力也相應(yīng)提高； C. dhfr基因的長度為 31kb，但被擴(kuò)增的 DNA長度可達(dá)500~1 000kb； D. 當(dāng) MTX壓力解除后， dhfr基因?qū)⒅饾u減少； E. 當(dāng)與 dhfr基因相連的外源 DNA導(dǎo)入細(xì)胞后，有整合到內(nèi)源 dhfr基因位點(diǎn)的趨勢。 3. dhfr加壓系統(tǒng)的應(yīng)用 EPO（促紅細(xì)胞生成素）的高效表達(dá)。 pCMV/EPO CHO cell line/dhfr Stable High Expression MTX Transformation EPO Extraction 八、整合與表達(dá)的鑒定 （一）整合鑒定 1. PCR； 2. Southern and Dot blot； 3. Sequencing （二）表達(dá)鑒定 1. RTPCR and Northern blot 2. RIA 3. SDSPAGE(TricineSDSPAGE) 4. HPLC 5. Western blot （三）蛋白結(jié)構(gòu)鑒定： 序列；立體構(gòu)象。 （四）功能檢測 活性測定；機(jī)體生理生化功能、性狀的改變。 九、其他重要技術(shù) 如何研究某種生物未知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能？ 1. 首先明確該蛋白的來源：原核或真核生物。 2. 將該蛋白提取純化，純度達(dá) 97%以上，氨基酸序列測定； 或利用該純化蛋白免疫動(dòng)物，例如兔子 /豚鼠等，制備特異性抗體。 3. 表達(dá) cDNA文庫 +in situ immunoblot方法。 4. RTPCR法。 如何研究某種已知蛋白的調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能？
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