【正文】 F1）和蠑螈酸性成纖維生長因子（nFGF1）氨基酸序列具有約80%同源性，并且具有結(jié)構(gòu)同源性（12個β折疊反向平行排列形成β折疊桶），在鹽酸胍誘導(dǎo)去折疊的過程中，hFGF1可以監(jiān)測到具有熔球體樣的折疊，而nFGF1經(jīng)由兩態(tài)（天然狀態(tài)到變性狀態(tài)）去折疊，沒有檢測到的存在，折疊的動力學(xué)研究也表明兩種蛋白采用不同的折疊機(jī)制（38）。 包涵體的分離和溶解由于鹽酸胍溶解包涵體蛋白質(zhì)能力比尿素強(qiáng)，而且尿素中的異氰酸酯可以使自由氨基氨甲?；ㄟ@種作用在堿性條件下表現(xiàn)的更強(qiáng)），所以常常首選鹽酸胍作為解離劑。Panda等在高pH 條件下使用低濃度的尿素溶解包涵體蛋白質(zhì)，用于重組牛生長激素、重組人生長激素和獼猴透明帶糖蛋白的變復(fù)性，認(rèn)為在變性時(shí)蛋白質(zhì)所保留的天然二級結(jié)構(gòu)有助于蛋白的折疊，減少蛋白質(zhì)的聚集。聯(lián)合使用高壓和低濃度的變性劑已用于包涵體蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體的變性，是一種有前景的變性方法（31,83)。已經(jīng)發(fā)展了很多的方法用于包涵體的折疊復(fù)性，但是這些方法的結(jié)果并不可預(yù)測，每一種方法都需要對各種實(shí)驗(yàn)條件，如變性劑濃度、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度、添加劑的濃度，進(jìn)行優(yōu)化選擇。為了控制折疊、錯誤折疊和聚集的速率，一種方法是降低變性劑的濃度，降低的速度和操作的時(shí)間都決定折疊的效率。甘油，對蛋白質(zhì)具有優(yōu)先的水合作用/增加黏度木糖醇，增加黏度Triton X100，保護(hù)非極性表面三氟乙醇（TFE），促進(jìn)二級結(jié)構(gòu)的形成聚乙二醇，保護(hù)熔球體（molten globule）/增加黏度在折疊過程中另一個關(guān)鍵的問題是正確二硫鍵的形成，一旦形成了錯誤的二硫鍵，就不能再折疊形成正確的結(jié)構(gòu)，所以在折疊時(shí)不僅要氧化促進(jìn)二硫鍵的形成，還要加入還原劑促進(jìn)二硫鍵改組（disulfidebond reshuffling），使蛋白質(zhì)最終折疊成正確的結(jié)構(gòu)。人絨毛膜促性腺激素β亞基（hCGβ）含有12個半胱氨酸殘基，如果不進(jìn)行巰基保護(hù)，在折疊復(fù)性中會形成寡聚體和大量沉淀，變性蛋白質(zhì)磺酸化后再折疊復(fù)性可形成幾乎100%單體蛋白，同時(shí)提高了得率和純度（37）。用折疊緩沖液快速稀釋溶解的包涵體蛋白質(zhì)溶液，達(dá)到降低變性劑濃度的目的，使去折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行再折疊，就是稀釋復(fù)性。在已經(jīng)發(fā)展的復(fù)性方法中，稀釋復(fù)性仍然是應(yīng)用最多的方法，但在放大時(shí)會因?yàn)樘幚眢w積太大造成成本太高。第一類型的色譜復(fù)性就是凝膠過濾色譜復(fù)性，這一方法的原理在于通過分子篩效應(yīng)可將蛋白質(zhì)和小分子的變性劑分離，實(shí)現(xiàn)溶液交換和蛋白質(zhì)的折疊。另一種方法是在介質(zhì)上固定化伴侶分子或折疊酶，使層析柱成為一個折疊反應(yīng)器，固定化的優(yōu)點(diǎn)是能夠回收使用，不會引入新的雜蛋白。血小板衍生的生長因子（PDGF）由兩個亞基組成，M252。通常選擇線性的梯度用于折疊復(fù)性，對于不同的蛋白質(zhì)還有其它的模式，如一些蛋白在特定的變性劑濃度范圍里不穩(wěn)定，在此變性劑濃度范圍里就需要快速降低變性劑濃度。另外應(yīng)用連續(xù)環(huán)形色譜，蛋白樣品連續(xù)上樣于旋轉(zhuǎn)的色譜柱上，在提高折疊效率的同時(shí)，也提高了色譜復(fù)性處理的能力（29,30）。由于蛋白質(zhì)結(jié)合在固相介質(zhì)上，減少了折疊過程中由于分子間相互作用所造成的聚集，所以這一方法可提高折疊的效率。由于蛋白質(zhì)或肽類標(biāo)簽在變性條件大多失去了與親和介質(zhì)結(jié)合的特性，目前這一技術(shù)用的最多的是組氨酸標(biāo)簽。除了以上的應(yīng)用，更令人鼓舞的是這一技術(shù)已成功用于膜蛋白的復(fù)性（24,50,71）。分子伴侶和折疊酶在蛋白質(zhì)的正確折疊中起著重要的作用，是近年來的一個研究熱點(diǎn)，它們和蛋白質(zhì)在體內(nèi)共表達(dá)已經(jīng)成為促進(jìn)蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的重要方法。將重組蛋白分泌到周質(zhì)間隙或細(xì)胞外可避免破碎細(xì)胞和處理細(xì)胞碎片，而且雜蛋白的種類和量都要少得多（在周質(zhì)空間大約有100種不同蛋白質(zhì)，而在胞漿內(nèi)有大約4000種不同的蛋白）。對于表達(dá)于細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)，先要破碎細(xì)胞后分離細(xì)胞膜，再抽提溶液進(jìn)行膜蛋白的提取，由于膜蛋白具有疏水區(qū)域，在抽提溶液中需要加入表面活性劑，一方面破壞細(xì)胞膜，溶解膜結(jié)構(gòu)，另一方面促進(jìn)膜蛋白的溶解和穩(wěn)定，常用Triton X100、 脫氧膽酸鈉、Brij等弱的表面活性劑來保留蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。釋放出目標(biāo)蛋白后，再進(jìn)行液相和固相細(xì)胞碎片的分離，得到澄清的蛋白質(zhì)溶液就可以進(jìn)行下游的分離純化了，涉及膜分離技術(shù)、沉淀分離技術(shù)、萃取技術(shù)、層析技術(shù)、電泳分離技術(shù)，以及一些整合技術(shù)，如擴(kuò)張床吸附，雙水相萃取。層析技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離純化開始于60年代，現(xiàn)在已成為蛋白質(zhì)分離純化的高分辨的方法。層析技術(shù)的另一個發(fā)展方向是功能基團(tuán)的發(fā)展，適應(yīng)不同的選擇性要求，如各種不同親和層析介質(zhì)的合成，使一步純化就能達(dá)到很高的純度。凝膠過濾層析是基于液相的分離方法，凝膠包裹的內(nèi)環(huán)境形成固定相，凝膠的外環(huán)境形成流動相，蛋白質(zhì)分子越大越不容易滲透進(jìn)入固定相，所以又稱為分子篩層析，層析的分辨率與介質(zhì)的排阻極限和上樣的體積有關(guān)，是一種易于操作的層析方法，另外凝膠過濾層析常用于緩沖液交換，此時(shí)可使用較大的載量。羥基磷灰石層析常用于的分離純化，對其分離的機(jī)制還了解的不清楚，但涉及介質(zhì)上鈣離子和磷酸根與蛋白上帶電殘基的相互作用。利用DNA重組技術(shù)，進(jìn)行目標(biāo)蛋白的融合表達(dá)，再用親和層析進(jìn)行分離純化，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)表達(dá)純化的常用手段。 親和標(biāo)簽的在重組蛋白分離純化中的應(yīng)用除了方便分離純化，親和標(biāo)簽的融合表達(dá)還有以下的優(yōu)點(diǎn)：但要注意的是可溶性表達(dá)并不能保證正確的折疊，融合蛋白可以形成可溶性的聚集體（106）。 加入的標(biāo)簽提供檢測目標(biāo)蛋白的高靈敏度方法，如表位標(biāo)簽可以使用ELISA和Western blotting 進(jìn)行定性和定量檢測。 親和融合策略已廣泛用于蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用研究和蛋白質(zhì)復(fù)合物研究（99）。 改善蛋白的藥代和藥動學(xué)特性，如一些細(xì)胞因子和免疫球蛋白G（IgG）的Fc段融合，可以性顯著增加半衰期，與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合也可以起到相同的效果。 親和標(biāo)簽是否會影響到目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能含有多對二硫鍵的蛋白質(zhì)或某些蛋白在進(jìn)行非融合表達(dá)時(shí)，常容易形成包涵體，或有降解發(fā)生。親和標(biāo)簽可以加在N端，可以加在C端，也進(jìn)行串聯(lián)，如圖5 所示，在選擇融合位置的時(shí)候，要考慮所處位置對標(biāo)簽親和性的影響，如GST適合加在N端，還要考慮融合可能對目標(biāo)蛋白的影響，如果目標(biāo)蛋白的Ｃ端序列包埋在蛋白的內(nèi)部，那么進(jìn)行Ｃ端融合就不合適。進(jìn)行分泌表達(dá)時(shí)，常選用可分泌的親和標(biāo)簽，有些親和標(biāo)簽不適合于放在N端，如6His標(biāo)簽放在N端會影響重組蛋白信號肽的處理和目標(biāo)蛋白的分泌，這是因?yàn)?His標(biāo)簽具有多個帶電咪唑殘基。4.組氨酸標(biāo)簽在非變性和變性條件下通常均可進(jìn)行親和純化，除了前面的這種方法可以使用，大多數(shù)情況下直接在變性條件下進(jìn)行親和純化或親和層析復(fù)性，而且親和層析復(fù)性常?？梢蕴岣哒郫B的效率。 親和標(biāo)簽對表達(dá)水平的影響表4 列出了親和洗脫的條件，有些條件比較溫和，而有些條件較為劇烈，選擇的親和表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)該不使目標(biāo)蛋白變性。 親和介質(zhì)和緩沖液的費(fèi)用融合蛋白是否需要去除標(biāo)簽，由目標(biāo)蛋白的用途和標(biāo)簽的特點(diǎn)來確定，如果用于免疫動物生產(chǎn)，則不需要，如果不影響蛋白的功能研究，也不需要，如果影響了蛋白的功能研究或用于臨床治療，則需要去除標(biāo)簽。但如果親和標(biāo)簽影響了目標(biāo)蛋白的功能，或?yàn)榱私Y(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和治療用途，就必須在融合標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白之間加入特異的剪切位點(diǎn)，以便去除親和標(biāo)簽，可用的方法有化學(xué)法和酶法，如表5 所示，在選擇這些方法時(shí)除要考慮選擇性等因素外，還要考慮標(biāo)簽去除后氨基酸的殘留 ，目前C端的標(biāo)簽沒有很好的方法去除，都會在目標(biāo)蛋白的C端引入額外的氨基酸，針對N端標(biāo)簽已有幾種蛋白酶在酶切后可使目標(biāo)蛋白不帶額外的氨基酸殘基。Jenny等對凝血酶和凝血因子Ⅹa蛋白酶的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，認(rèn)為盡管它們在很多應(yīng)用中能夠在設(shè)計(jì)的位點(diǎn)進(jìn)行特異性酶切，但常常會發(fā)生目標(biāo)蛋白其它位點(diǎn)的酶解，所以在去除親和標(biāo)簽后要對目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒定，以確保蛋白的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化（105）。溴化氰，Met^，需要70%甲酸，室溫凝血因子Ⅹa蛋白酶，IleGlu/AspGlyArg^，如果在精氨酸后為脯氨酸和精氨酸則不能剪切，為內(nèi)切酶，在GlyArg后存在非特異性剪切二肽基氨基肽酶，(Xaa)2n^XaaPro, (Xaa)2n^Xaa Xaa –Pro, His表位標(biāo)簽和金屬螯合親和層析 金屬螯和親和層析技術(shù)是由Porath及其合作者在70年代中期發(fā)展起來的，這一方法基于蛋白質(zhì)表面的一些特定的氨基酸殘基側(cè)鏈，尤其是組氨酸，在中性和弱堿性條件下可以和固定化的金屬離子相互作用，如Ni2+、Zn2+和Co2+，目前His標(biāo)簽已經(jīng)成為應(yīng)用最為廣泛的親和標(biāo)簽。硫氧還蛋白（thioredoxin）作為融合標(biāo)簽可以促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)，Lu等將硫氧還蛋白表面的4個氨基酸殘基進(jìn)行系統(tǒng)性的突變，發(fā)現(xiàn)E30H和Q62H兩個組氨酸突變可以使硫氧還蛋白螯和固定化的鎳離子，S1H突變可以進(jìn)一步促進(jìn)這種相互作用，從而給硫氧還蛋白打上一個組氨酸補(bǔ)?。╤istine patch），同時(shí)保留了野生型分子促進(jìn)可溶性表達(dá)的能力，突變蛋白hpTrxA和野生型硫氧還蛋白融合表達(dá)的水平相一致，并能用金屬螯和層析方便的進(jìn)行融合蛋白的純化（104）。2 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶蛋白（GST）標(biāo)簽是最早使用的親和標(biāo)簽，目標(biāo)蛋白加于GST的C端，再利用谷胱甘肽親和介質(zhì)進(jìn)行純化，或固定在親和介質(zhì)上進(jìn)行蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用研究，GST pulldown實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)相互作用的常用方法。GST標(biāo)簽常被選擇用于增加可溶性表達(dá)，但實(shí)際上并不有效， Waugh的小組選擇了10個可溶性表達(dá)不好的蛋白作為研究對象，GST融合并不能增強(qiáng)負(fù)載蛋白的可溶性表達(dá)（103,106）。作為親和融合的標(biāo)簽，Protein A具有以下優(yōu)點(diǎn)：1 在各種宿主細(xì)胞中，Protein A耐蛋白酶的降解，高度穩(wěn)定；2 每個IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成3螺旋捆狀結(jié)構(gòu)，兩端都是親水的結(jié)構(gòu)，使得Protein A的折疊不依賴于目的蛋白的折疊；3 Protein A不含有半胱氨酸，否者可能干擾目的蛋白二硫鍵的形成；3 Protein A高度可溶，在變性條件下復(fù)性的效率高，有助于融合蛋白包涵體的溶解和折疊；4 可引入不同的酶切位點(diǎn)，不影響目標(biāo)蛋白的酶切；5 加上信號肽序列，可使融合蛋白進(jìn)行大腸桿菌周質(zhì)表達(dá)，某些情況下，可進(jìn)行胞外表達(dá)。G252。白蛋白結(jié)合區(qū)域在大腸桿菌中表達(dá)高度可溶，性質(zhì)穩(wěn)定，不被蛋白酶降解，結(jié)合上信號肽能有效的分泌。 Strep Tag 系統(tǒng)是通過篩選噬菌體隨機(jī)肽庫而得到的短肽（含9個氨基酸殘基），將其進(jìn)行目標(biāo)蛋白的C端融合可以模擬生物素和鏈霉抗生物素蛋白特異性相互作用，使用亞胺生物素洗脫。這一系統(tǒng)使用交聯(lián)直鏈淀粉的親和介質(zhì)純化，用麥芽糖進(jìn)行競爭性洗脫，具有如下優(yōu)點(diǎn)：1 MBP不含有半胱氨酸殘基，不會干擾目標(biāo)蛋白形成正確的二硫鍵；2 使用的介質(zhì)價(jià)格低廉；3 可以在溫和的條件下洗脫融合蛋白；4 加上其分泌信號，可以進(jìn)行分泌表達(dá)在細(xì)胞周質(zhì)，由于周質(zhì)是偏氧化的環(huán)境，可以促進(jìn)目標(biāo)蛋白形成正確的二硫鍵；5 這一系統(tǒng)最顯著的特點(diǎn)是與麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）進(jìn)行融合表達(dá)可以改善目標(biāo)蛋白的溶解性，促進(jìn)正確折疊，提高活性蛋白的回收率，實(shí)驗(yàn)證明MBP比硫氧還蛋白和GST都要有效（103,106）。6這一系統(tǒng)包括以下幾類：1 巰基誘導(dǎo)的N端剪切系統(tǒng)（相對內(nèi)含肽來講），有pTYB1和其衍生載體，使用的內(nèi)含肽來源于釀酒（Saccharomyces cerevisiae）VMA1基因，將最后一個氨基酸進(jìn)行了N454A突變，使內(nèi)含肽的C端不能被剪切，在巰基的誘導(dǎo)下，內(nèi)含肽的N端發(fā)生重排、裂解、水解，就得到目標(biāo)蛋白，由于細(xì)菌表達(dá)，目標(biāo)蛋白N端有甲硫氨酸，C端不引入額外的氨基酸殘基；2 巰基誘導(dǎo)的C端剪切系統(tǒng)，有pTYB11和pTYB12載體，同樣使用來源于釀酒VMA1基因的內(nèi)含肽，內(nèi)含肽C端的剪切依賴于其Ｎ端剪切位點(diǎn)的巰基誘導(dǎo)裂解，幾丁質(zhì)結(jié)合肽序列插入到內(nèi)含肽的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，Ｎ端為半胱氨酸的蛋白不能使用這一系統(tǒng)剪切；３ pH誘導(dǎo)的C端剪切系統(tǒng)，有pTWIN 載體，內(nèi)含肽來源于一種藍(lán)細(xì)菌的dnaB基因，有429個氨基酸殘基，N端的半胱氨酸殘基被丙氨酸殘基取代，使內(nèi)含肽不具有N端的裂解活性，而保留C末端pH誘導(dǎo)剪切的特性，剪切能有效進(jìn)行，pH，內(nèi)含肽的N端融合幾丁質(zhì)結(jié)合肽，C端融合目標(biāo)序列，在pH ℃條件下剪切； 4可以用于蛋白質(zhì)環(huán)化的雙內(nèi)含肽系統(tǒng)，目的蛋白處于兩個內(nèi)含肽之間，先通過pH誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白N端內(nèi)含肽被剪切，再用巰基誘導(dǎo)C端內(nèi)含肽被剪切，剪切后產(chǎn)生N端為半胱氨酸殘基和C端為硫脂鍵的蛋白，通過自發(fā)的縮合可形成環(huán)化蛋白。 FLAG表位標(biāo)簽，T7表位標(biāo)簽和S標(biāo)簽FLAG標(biāo)簽的最初用途是用于蛋白檢測，可以在飛摩爾水平特異性檢測目標(biāo)蛋白，Sigma將3個FLAG表位（DYKD）串聯(lián)，中間以兩個氨基酸間隔，可以將蛋白分析靈敏度提高1020倍。 親和標(biāo)簽的比較和選擇Hammarstr246。使用H10MBP融合（MBP前面加上10個組氨酸的標(biāo)簽），95個蛋白中有63個蛋白可溶性表達(dá)的水平大于1mg/l，未成功表達(dá)的蛋白大多具有分子量高、毗鄰疏水氨基酸個數(shù)多和低復(fù)雜性區(qū)域多的特征，進(jìn)一步驗(yàn)證了前面的結(jié)論。另外要考慮的就是原材料的性質(zhì)，包括來源于什么表達(dá)系統(tǒng)（如細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞），主要的雜蛋白（如宿主細(xì)胞蛋白、產(chǎn)品的不同變體），需要處理的固體（如細(xì)胞、膜碎片、包涵體），以及蛋白的性質(zhì)（如所帶電荷、滴定曲線、等電點(diǎn)、分子量、表面疏水性、特異的結(jié)合特性和熱穩(wěn)定性），這些信息都有助于每一步分離純化工藝的開發(fā)。31 / 3