《酶的分離和純化》ppt課件-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 ↓ ? 加熱 90100℃ （ 水浴加熱 ） ? b） 層析柱準(zhǔn)備： 100柱； 稠膠灌柱； 23個(gè)床體積的緩沖液平衡； 流速 1618ml/h ? c） 層析：蘭葡聚糖 （ 分子量 2 106） 驗(yàn)柱并求外水體積 （ V0） ；上樣量 15% ； ? 恒壓洗脫； 流速 1618ml/h ? d） 凝膠后處理： NaOH+ NaCl處理后 4℃保存 ? 長(zhǎng)時(shí)間不用可采用乙醇脫水保存或低溫干燥保存 凝膠過(guò)濾層析原理圖 Gel filtration chromatography 5） 親和層析 （ affinity chromatography） 特異性結(jié)合 ? a） 關(guān)鍵：配體；配體與支持物的連接方法；吸附 、 洗脫條件 ? b） 支持物的選擇：非特異性吸附作用低；液體流動(dòng)性好；較寬的 pH、 離子強(qiáng)度；豐富的化學(xué)基團(tuán)；有效的多孔性 常用瓊脂糖 、 聚丙烯酰胺凝膠和受控多孔玻璃球 ? c） 配體的選擇：有親和力但不易過(guò)大 ? d） 配體與支持物的連接：載體結(jié)合法；物理吸附法；交聯(lián)法；包埋法 （ 先活化支持物上的功能基團(tuán)再將配體連上去 ） ? e） 吸附劑的衍生物：支持物 +空間臂 ? f） 層析條件的選擇：蛋白質(zhì) +配體 → 蛋白質(zhì) 配體復(fù)合物 起初配體濃度恒定 ， 隨蛋白濃度增加平衡右移 （ 逐漸保留特性 ） ，故親和力較低也能成功的親和 。大氣壓 /摩爾 /度 ） ， T為絕對(duì)溫度 。 超速離心法 )1( ???=DS R TM? M：分子量 S：沉降系數(shù) R：氣體常數(shù) T：絕對(duì)溫度 D：擴(kuò)散系數(shù) υ：溶質(zhì)分子微分比容 ρ：介質(zhì)密度 SDS聚丙烯酰胺電泳法 M —— 被測(cè)蛋白分子量 a， b —— 常數(shù) ， 用已知分子量蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線求得 de —— 酶蛋白的泳動(dòng)距離 do —— 小分子染料的泳動(dòng)距離 ? 亞基分子量 dodebaM ??=l o g SDSPAGE的分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線 凝膠層析法 M —— 被測(cè)蛋白分子量 a， b —— 常數(shù) ， 用已知分子量蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線求得 Ve —— 酶蛋白洗脫體積 Vo —— 空體積 （ 可用藍(lán)葡聚糖求得 ） VoVebaM ?=l o g 凝膠過(guò)濾分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線 思考題 ? 下表是一種酶的各個(gè)純化步驟的總蛋白和總活性單位數(shù)。 整個(gè)純化過(guò)程的收率是多少 ？ 純化了多少倍 ？
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