【正文】 超聲波處理。,(1) 去除雜質(zhì)。,a.如果所要的蛋白質(zhì)主要集中在某一細胞組分, 可利用差速離心別離。,1.蛋白質(zhì)樣品(y224。nɡ suō)蛋白質(zhì)的細分級別離,主要方法： 凝膠過濾、離子交換層析(c233。,輔助(fǔzh249。盡管結(jié)晶并不能保證蛋白質(zhì)一定是均一的,但只有某種蛋白質(zhì)在溶液中數(shù)量上占優(yōu)勢時才能(c225。,蛋白質(zhì)的結(jié)晶不僅是純度的一個標志,也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。)純化的一般步驟,第二十七頁，共一百一十三頁。,第二十八頁，共一百一十三頁。o)方法： 1：透析〔dialysis〕和超過濾〔ultrafiltration〕 2：密度梯度〔區(qū)帶〕離心 3：凝膠過濾法,第二十九頁，共一百一十三頁。n)，袋內(nèi)溶質(zhì)向袋外滲透，趨向濃度平衡。),第三十一頁，共一百一十三頁。)屢次更換透析液，就可除去小分子。,超過濾裝置(zhuāngzh236。,2：密度梯度〔區(qū)帶〕離心(l237。d249。d249。,第三十四頁，共一百一十三頁。)：混和蛋白質(zhì)樣品,離心裝置,第三十五頁，共一百一十三頁。,第三十六頁，共一百一十三頁。 其內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，單個凝膠珠本身象個“篩子〞。)的選擇,凝膠的交聯(lián)度或孔度〔網(wǎng)孔大小〕決定了凝膠的分級別離范圍，即能被該凝膠別離開來的蛋白質(zhì)混合物的相對分子質(zhì)量范圍進行凝膠過濾。,〔３〕凝膠過濾(gu242。ng)路程長，而且受到來自凝膠珠內(nèi)部的阻力也很大，所以越小的蛋白質(zhì)，把它們從柱子上洗脫下來所花費的時間越長。,凝膠過濾(gu242。ng)大小不同的蛋白質(zhì)就被別離開來了。,〔一〕根據(jù)蛋白質(zhì)分子(fēnzǐ)大小不同的純化方法,主要(zhǔy224。) 2：蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析 3：有機溶劑分級別離法 4：改變溫度,第四十三頁，共一百一十三頁。j237。,第四十四頁，共一百一十三頁。,通過這種方法沉淀出來的蛋白質(zhì)可以保持天然構(gòu)象(ɡ242。,2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析(y225。,同濃度二價中性鹽對蛋白質(zhì)溶解度的影響比單價中性鹽大的多。)到達一定的數(shù)值時〔鹽濃度高達一定數(shù)值時〕，蛋白質(zhì)的溶解度開始下降，很多蛋白質(zhì)可以從水溶液中析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。)純化蛋白質(zhì)的過程中最常用的方法之一，鹽析出的蛋白質(zhì)仍然保持蛋白的天然構(gòu)象。nɡ)的有機溶劑〔如甲醇、乙醇和丙酮等〕 能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低，在室溫下，這些有機溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。,4.改變溫度(wēnd249。,一般蛋白質(zhì)的分級別離操作一般都在0~4oC溫度(wēnd249。)蛋白質(zhì)溶解度不同的純化方法 〔蛋白質(zhì)的膠體和沉淀性質(zhì)〕,主要方法： 1：等電點沉淀(ch233。)蛋白質(zhì)電荷不同的純化方法,主要方法(fāngfǎ)： 電泳 離子交換層析,第五十一頁，共一百一十三頁。ng)稱為電泳(electrophoresis)。n yǒnɡ)概述,由于蛋白質(zhì)在指定的PH溶液中所帶電荷(di224。,第五十三頁，共一百一十三頁。 等速電泳：需專用電泳儀，當電泳到達平衡后，各區(qū)帶隨分成清晰的界面，并以等速移動。,按別離(fēnl237。,應(yīng)用于蛋白質(zhì)別離(fēnl237。由于界面處存在濃度梯度因而(yīn 233。,區(qū)帶電泳(di224。,1.聚丙烯酰胺凝膠電泳,(polyacrylaminde gel electrophoresis) PAGE電泳(di224。,第五十八頁，共一百一十三頁。 聚丙烯酰胺凝膠孔徑可調(diào)，根據(jù)被別離物的分子量選擇適宜的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑大小。ng)廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的別離、定性、定量及少量的制備，還可測定分子量、等電點等。,第六十頁，共一百一十三頁。,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置(zhuāngzh236。y224。 ② 用途：別離多種生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、DNA片段〔例如(l236。,第六十五頁，共一百一十三頁。jiāo)，是一種高分辨率的蛋白質(zhì)別離技術(shù)，它也可用于蛋白質(zhì)等電點的測定。ng)一個很窄的區(qū)帶。,第六十六頁，共一百一十三頁。所用的緩沖液是低分子量的有機酸和堿的混合物，該混合物稱之兩性電解質(zhì)。o)別離的目的。h233。,雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色蛋白呈現(xiàn)二維分布圖，水平方向反映出蛋白在pI上的差異，而垂直(chu237。,第七十頁，共一百一十三頁。,第七十二頁，共一百一十三頁。 zǐ jiāo hu224。d236。h233。,利用待純化(chng)的吸附劑：硅膠,氧化鋁和活性炭等. 主要用來別離非離子、水不溶性化合物,〔四〕利用選擇性吸附的純化(ch 經(jīng)常只需一步處理即可將某種所需蛋白質(zhì)從復雜混合物中別離出來，純度相當高。,親和層析,把某一待純化蛋白質(zhì)的特異配體通過適當?shù)幕瘜W反響共價地連接到像瓊脂糖凝膠這一類的載體(z224。,?,第八十二頁，共一百一十三頁。,蛋白質(zhì)的別離純化(ch,第三節(jié) 蛋白質(zhì)分子量的測定(c232。d236。,例如:某種蛋白含鐵量為0.335%, 其最低相對分子質(zhì)量(假設(shè)此蛋白只含有一個(yī ɡ232。,滲透(sh232。)分子質(zhì)量,第九十頁，共一百一十三頁。,本卷須知：盡量采用等電點或者接近等電點的緩沖溶液(huǎn chōnɡ r243。 缺點：不能區(qū)別所測蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì)樣品是否(sh236。,〔三〕蛋白質(zhì)的擴散(ku242。n)系數(shù),擴散〔平移擴散〕：由于(y243。)當濃度梯度為一個單位時，在一秒鐘內(nèi)通過1cm2面積所擴散的溶質(zhì)量。ng)相對分子質(zhì)量,需轉(zhuǎn)速(zhu224。,1. 沉降速度法測定相對分子(fēnzǐ)質(zhì)量,沉降系數(shù)(s):單位(dānw232。,第九十四頁，共一百一十三頁。校正后的沉降系數(shù)用s20，w表示。 即：1S＝1013秒,第九十五頁，共一百一十三頁。nji224。由于分子顆粒沉降造成濃度梯度，因而產(chǎn)生了擴散作用。d236。 因此,標準蛋白質(zhì)(Mr和斯托克半徑)和待測蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀(接近球體),否那么不能得到比較準確的Mr。,第一百頁，共一百一十三頁。,1966年Andrews提出(t237。,第一百零四頁，共一百一十三頁。n)統(tǒng)一的長橢圓形。ng),電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)有以下關(guān)系：,第一百零六頁，共一百一十三頁。ng)的測定與純度鑒定,第一百零八頁，共一百一十三頁。 雙縮脲法：純化步驟(b249。 紫外吸收法：雖然精確度不高,但操作簡便。nd249。,2.沉降分析法：純的蛋白質(zhì)在離心場中以單一(dānyī)的沉降速度移動。,第一百一十頁，共一百一十三頁。zhēng) 蛋白質(zhì)別離純化的一般步驟 蛋白質(zhì)別離純化的標準和主要方法 蛋白質(zhì)分子量測定的主要方法 蛋白質(zhì)含量測定與純度測定的主要方法,第一百一十二頁，共一百一十三頁。當?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點時,加熱凝固最完全和最迅速。)紫外吸收法測定吸