【正文】 超聲波處理。,(1) 去除雜質。,a.如果所要的蛋白質主要集中在某一細胞組分, 可利用差速離心別離。,1.蛋白質樣品(y224。nɡ suō)蛋白質的細分級別離,主要方法： 凝膠過濾、離子交換層析(c233。,輔助(fǔzh249。盡管結晶并不能保證蛋白質一定是均一的,但只有某種蛋白質在溶液中數量上占優(yōu)勢時才能(c225。,蛋白質的結晶不僅是純度的一個標志,也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。)純化的一般步驟,第二十七頁，共一百一十三頁。,第二十八頁，共一百一十三頁。o)方法： 1：透析〔dialysis〕和超過濾〔ultrafiltration〕 2：密度梯度〔區(qū)帶〕離心 3：凝膠過濾法,第二十九頁，共一百一十三頁。n)，袋內溶質向袋外滲透，趨向濃度平衡。),第三十一頁，共一百一十三頁。)屢次更換透析液，就可除去小分子。,超過濾裝置(zhuāngzh236。,2：密度梯度〔區(qū)帶〕離心(l237。d249。d249。,第三十四頁，共一百一十三頁。)：混和蛋白質樣品,離心裝置,第三十五頁，共一百一十三頁。,第三十六頁，共一百一十三頁。 其內部是多孔的網狀結構，單個凝膠珠本身象個“篩子〞。)的選擇,凝膠的交聯度或孔度〔網孔大小〕決定了凝膠的分級別離范圍，即能被該凝膠別離開來的蛋白質混合物的相對分子質量范圍進行凝膠過濾。,〔３〕凝膠過濾(gu242。ng)路程長，而且受到來自凝膠珠內部的阻力也很大，所以越小的蛋白質，把它們從柱子上洗脫下來所花費的時間越長。,凝膠過濾(gu242。ng)大小不同的蛋白質就被別離開來了。,〔一〕根據蛋白質分子(fēnzǐ)大小不同的純化方法,主要(zhǔy224。) 2：蛋白質的鹽溶和鹽析 3：有機溶劑分級別離法 4：改變溫度,第四十三頁，共一百一十三頁。j237。,第四十四頁，共一百一十三頁。,通過這種方法沉淀出來的蛋白質可以保持天然構象(ɡ242。,2.蛋白質的鹽溶和鹽析(y225。,同濃度二價中性鹽對蛋白質溶解度的影響比單價中性鹽大的多。)到達一定的數值時〔鹽濃度高達一定數值時〕，蛋白質的溶解度開始下降，很多蛋白質可以從水溶液中析出，這種現象稱為鹽析。)純化蛋白質的過程中最常用的方法之一，鹽析出的蛋白質仍然保持蛋白的天然構象。nɡ)的有機溶劑〔如甲醇、乙醇和丙酮等〕 能使蛋白質在水中的溶解度顯著降低，在室溫下，這些有機溶劑不僅能引起蛋白質沉淀，而且伴隨著變性。,4.改變溫度(wēnd249。,一般蛋白質的分級別離操作一般都在0~4oC溫度(wēnd249。)蛋白質溶解度不同的純化方法 〔蛋白質的膠體和沉淀性質〕,主要方法： 1：等電點沉淀(ch233。)蛋白質電荷不同的純化方法,主要方法(fāngfǎ)： 電泳 離子交換層析,第五十一頁，共一百一十三頁。ng)稱為電泳(electrophoresis)。n yǒnɡ)概述,由于蛋白質在指定的PH溶液中所帶電荷(di224。,第五十三頁，共一百一十三頁。 等速電泳：需專用電泳儀，當電泳到達平衡后，各區(qū)帶隨分成清晰的界面，并以等速移動。,按別離(fēnl237。,應用于蛋白質別離(fēnl237。由于界面處存在濃度梯度因而(yīn 233。,區(qū)帶電泳(di224。,1.聚丙烯酰胺凝膠電泳,(polyacrylaminde gel electrophoresis) PAGE電泳(di224。,第五十八頁，共一百一十三頁。 聚丙烯酰胺凝膠孔徑可調，根據被別離物的分子量選擇適宜的濃度，通過改變單體及交聯劑的濃度調節(jié)凝膠的孔徑大小。ng)廣泛，可用于蛋白質、酶、核酸等生物分子的別離、定性、定量及少量的制備，還可測定分子量、等電點等。,第六十頁，共一百一十三頁。,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置(zhuāngzh236。y224。 ② 用途：別離多種生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白質、DNA片段〔例如(l236。,第六十五頁，共一百一十三頁。jiāo)，是一種高分辨率的蛋白質別離技術，它也可用于蛋白質等電點的測定。ng)一個很窄的區(qū)帶。,第六十六頁，共一百一十三頁。所用的緩沖液是低分子量的有機酸和堿的混合物，該混合物稱之兩性電解質。o)別離的目的。h233。,雙向電泳后的凝膠經染色蛋白呈現二維分布圖，水平方向反映出蛋白在pI上的差異，而垂直(chu237。,第七十頁，共一百一十三頁。,第七十二頁，共一百一十三頁。 zǐ jiāo hu224。d236。h233。,利用待純化(chng)的吸附劑：硅膠,氧化鋁和活性炭等. 主要用來別離非離子、水不溶性化合物,〔四〕利用選擇性吸附的純化(ch 經常只需一步處理即可將某種所需蛋白質從復雜混合物中別離出來，純度相當高。,親和層析,把某一待純化蛋白質的特異配體通過適當的化學反響共價地連接到像瓊脂糖凝膠這一類的載體(z224。,?,第八十二頁，共一百一十三頁。,蛋白質的別離純化(ch,第三節(jié) 蛋白質分子量的測定(c232。d236。,例如:某種蛋白含鐵量為0.335%, 其最低相對分子質量(假設此蛋白只含有一個(yī ɡ232。,滲透(sh232。)分子質量,第九十頁，共一百一十三頁。,本卷須知：盡量采用等電點或者接近等電點的緩沖溶液(huǎn chōnɡ r243。 缺點：不能區(qū)別所測蛋白質溶液中的蛋白質樣品是否(sh236。,〔三〕蛋白質的擴散(ku242。n)系數,擴散〔平移擴散〕：由于(y243。)當濃度梯度為一個單位時，在一秒鐘內通過1cm2面積所擴散的溶質量。ng)相對分子質量,需轉速(zhu224。,1. 沉降速度法測定相對分子(fēnzǐ)質量,沉降系數(s):單位(dānw232。,第九十四頁，共一百一十三頁。校正后的沉降系數用s20，w表示。 即：1S＝1013秒,第九十五頁，共一百一十三頁。nji224。由于分子顆粒沉降造成濃度梯度，因而產生了擴散作用。d236。 因此,標準蛋白質(Mr和斯托克半徑)和待測蛋白質必須具有相同的分子形狀(接近球體),否那么不能得到比較準確的Mr。,第一百頁，共一百一十三頁。,1966年Andrews提出(t237。,第一百零四頁，共一百一十三頁。n)統(tǒng)一的長橢圓形。ng),電泳遷移率與蛋白質分子量的對數有以下關系：,第一百零六頁，共一百一十三頁。ng)的測定與純度鑒定,第一百零八頁，共一百一十三頁。 雙縮脲法：純化步驟(b249。 紫外吸收法：雖然精確度不高,但操作簡便。nd249。,2.沉降分析法：純的蛋白質在離心場中以單一(dānyī)的沉降速度移動。,第一百一十頁，共一百一十三頁。zhēng) 蛋白質別離純化的一般步驟 蛋白質別離純化的標準和主要方法 蛋白質分子量測定的主要方法 蛋白質含量測定與純度測定的主要方法,第一百一十二頁，共一百一十三頁。當蛋白質處于等電點時,加熱凝固最完全和最迅速。)紫外吸收法測定吸