【正文】 一十三頁(yè)。),第六十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置(zhuāngzh236。,電泳(di224。y224。,2.毛細(xì)管電泳(di224。 ② 用途：別離多種生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、DNA片段〔例如(l236。)合成的寡核苷酸〕和核酸以及多種小分子，如藥物、甚至金屬離子。,第六十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。jiāo)電泳,等電聚焦(j249。jiāo)，是一種高分辨率的蛋白質(zhì)別離技術(shù)，它也可用于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定。在外電場(chǎng)作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦〔停留〕在等于其等電點(diǎn)的pH梯度處，并形成(x237。ng)一個(gè)很窄的區(qū)帶。此技術(shù)特別適用于同功酶的鑒定。,第六十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。y242。所用的緩沖液是低分子量的有機(jī)酸和堿的混合物，該混合物稱之兩性電解質(zhì)。jiāo)電泳裝置,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品在這樣的凝膠上電泳時(shí)，每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI 相一致的pH處，具有不同pI的各種蛋白質(zhì)最后都遷移至凝膠中相應(yīng)的pH處，到達(dá)(d225。o)別離的目的。,第六十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。h233。,等電聚焦(j249。,雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色蛋白呈現(xiàn)二維分布圖，水平方向反映出蛋白在pI上的差異，而垂直(chu237。)方向反映出它們?cè)诜肿恿可系牟町悺?第七十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)差異別離蛋白質(zhì)混合物的柱層析方法。,第七十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。nchōng)到層析柱中的樹脂有陽(yáng)離子交換型和陰離子交換型。 zǐ jiāo hu224。,以陽(yáng)離子交換(jiāohu224。d236。,第七十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。h233。,第七十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,利用待純化(ch)的分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附能力和解吸性質(zhì)不同而到達(dá)別離目的。ng)的吸附劑：硅膠,氧化鋁和活性炭等. 主要用來別離非離子、水不溶性化合物,〔四〕利用選擇性吸附的純化(ch)方法(P312),第七十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。 經(jīng)常只需一步處理即可將某種所需蛋白質(zhì)從復(fù)雜混合物中別離出來，純度相當(dāng)高。y236。,親和層析,把某一待純化蛋白質(zhì)的特異配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反響共價(jià)地連接到像瓊脂糖凝膠這一類的載體(z224。,第八十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,?,第八十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,第八十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,蛋白質(zhì)的別離純化(ch)方法,分子(fēnzǐ)大?。?溶解度： 電荷： 吸附性質(zhì)： 對(duì)配體分子的親和力：,透析和超過濾、密度梯度〔區(qū)帶〕離心(l237。,第三節(jié) 蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定(c232。ng)(P291299),第八十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。d236。 如Fe，并假設(shè)每個(gè)蛋白質(zhì)分子中只有1個(gè)Fe原子，那么由此可算出蛋白質(zhì)的最低相對(duì)分子質(zhì)量。,例如:某種蛋白含鐵量為0.335%, 其最低相對(duì)分子質(zhì)量(假設(shè)此蛋白只含有一個(gè)(yī ɡ232。nzǐ)〔如血紅蛋白〕 ，那么： Mr = 16 7004＝86 600,即某蛋白的真實(shí) Mr = 16 700n 〔n為含有的鐵原子(yu225。,滲透(sh232。u)現(xiàn)象：溶劑分子由純?nèi)軇不蛳∪芤骸诚蛉芤骸不驖馊芤骸硢畏较虻膬粢苿?dòng)現(xiàn)象。)分子質(zhì)量,第九十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。ngzh236。,本卷須知：盡量采用等電點(diǎn)或者接近等電點(diǎn)的緩沖溶液(huǎn chōnɡ r243。)做為半透膜內(nèi)外的溶劑，以防止PH值對(duì)滲透壓的影響。 缺點(diǎn)：不能區(qū)別所測(cè)蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì)樣品是否(sh236。如果溶液含多種蛋白質(zhì)成分，那么測(cè)出的是幾種蛋白質(zhì)的平均分子量。,〔三〕蛋白質(zhì)的擴(kuò)散(ku242。n)和擴(kuò)散(ku242。n)系數(shù),擴(kuò)散〔平移擴(kuò)散〕：由于(y243。)濃度差引起的溶質(zhì)分子的凈遷移。)當(dāng)濃度梯度為一個(gè)單位時(shí)，在一秒鐘內(nèi)通過1cm2面積所擴(kuò)散的溶質(zhì)量。,〔四〕沉降分析法測(cè)定(c232。ng)相對(duì)分子質(zhì)量,需轉(zhuǎn)速(zhu224。)為60,000～80,000rpm的超速離心機(jī),沉降：蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強(qiáng)大的離心力作用時(shí)，如果蛋白質(zhì)的密度大于溶液的密度，蛋白質(zhì)分子就會(huì)發(fā)生(fāshēng)沉降，沉降的速度與蛋白質(zhì)的分子大小、形狀、密度以及溶液的性質(zhì)有關(guān)。,1. 沉降速度法測(cè)定相對(duì)分子(fēnzǐ)質(zhì)量,沉降系數(shù)(s):單位(dānw232。,界面移動(dòng)的速度即沉降速度，溶質(zhì)的相對(duì)分子量越大，那么界面移動(dòng)越快，假設(shè)溶液中有幾種溶質(zhì)，那么離心之后就會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)界面。,第九十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。 為了比較起見，在不同溫度和溶劑中測(cè)得的沉降系數(shù)需要換算成標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)條件下的s值。校正后的沉降系數(shù)用s20，w表示。因此：把1013秒作為一個(gè)單位，稱為斯維得貝格單位或稱沉降系數(shù)單位，用S(大寫(d224。 即：1S＝1013秒,第九十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。),第九十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。nji224。nx237。由于分子顆粒沉降造成濃度梯度，因而產(chǎn)生了擴(kuò)散作用。,第九十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。d236。,如果某種蛋白質(zhì)與一理想的非水化球體(qi 因此,標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(Mr和斯托克半徑)和待測(cè)蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀(接近球體),否那么不能得到比較準(zhǔn)確的Mr。y242。,第一百頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,第一百零二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,1966年Andrews提出(t237。 ②不純樣品(y224。,第一百零四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。)分子質(zhì)量,SDS處理蛋白質(zhì)之后，所有的SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有了大量的負(fù)電荷，而且分子都呈現(xiàn)(ch233。n)統(tǒng)一的長(zhǎng)橢圓形。,在聚丙烯酰胺凝膠中由于引入凝膠分子篩效應(yīng)(xi224。ng),電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)有以下關(guān)系：,第一百零六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,第四節(jié) 蛋白質(zhì)含量(h225。ng)的測(cè)定與純度鑒定,第一百零八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。nli224。 雙縮脲法：純化步驟(b249。u)檢測(cè)。 紫外吸收法：雖然精確度不高,但操作簡(jiǎn)便。,第一百零九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。nd249。ngxi224。,2.沉降分析法：純的蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中以單一(dānyī)的沉降速度移動(dòng)。,4.溶解度分析：純的蛋白質(zhì)制品，溶解度曲線呈現(xiàn)一個(gè)折點(diǎn)。,第一百一十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。jiāo) 雙向電泳 滲透現(xiàn)象 擴(kuò)散 擴(kuò)散系數(shù) 蛋白質(zhì)的沉降 沉降系數(shù) 蛋白質(zhì)的斯托克半徑,名詞解釋,第一百一十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。zhēng) 蛋白質(zhì)別離純化的一般步驟 蛋白質(zhì)別離純化的標(biāo)準(zhǔn)和主要方法 蛋白質(zhì)分子量測(cè)定的主要方法 蛋白質(zhì)含量測(cè)定與純度測(cè)定的主要方法,第一百一十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。ir243。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí),加熱凝固最完全和最迅速。b.如果所要純化蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合,那么用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當(dāng)介質(zhì)提取。)紫外吸收法測(cè)定吸收峰。經(jīng)常只需一步處理即可將某種所需蛋白質(zhì)從復(fù)雜混合物中別離出來，純度相