【正文】 電聚焦(j249。ngch233。只要它們的pI有0.02〔甚至0.02〕pH單位的差異就能分開。ng)下在凝膠內(nèi)沿電場(chǎng)方向制造一個(gè)pH梯度。 d224。,4.蛋白質(zhì)的雙向電泳〔twodimensional electrophoresis〕,將等電聚焦電泳與SDSPAGE結(jié)合(ji233。jiāo)電泳,SDSPAGE,第六十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。 所以雙向電泳可以將分子量相同而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)以及等電點(diǎn)相同而分子量不同的蛋白質(zhì)分開。,5.層析聚焦(P310),第七十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,6.離子交換(l237。n)型樹脂為例,將帶有耐酸性非常強(qiáng)的磺酸根SO3Na＋〔以鹽的形式出現(xiàn)〕的強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹脂〔固定(g249。,結(jié)合(ji233。,第七十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,典型(diǎnx237。,親和層析(affinity chromatography)：是利用蛋白質(zhì)分子(fēnzǐ)對(duì)其配體分子(fēnzǐ)特有的識(shí)別能力, 即生物學(xué)親和力，建立起來(lái)的一種有效的純化方法。)生物學(xué)親和力的純化方法(P313),第七十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,樣品,層析柱,第八十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,第八十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。xīn)、凝膠過濾法,等電點(diǎn)和PH值控制、鹽溶鹽析、有機(jī)溶劑分級(jí)別離、變溫度,電泳、離子交換層析,親和層析,第八十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,一、根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定(c232。,第八十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。nzǐ)的數(shù)目〕,第八十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,二、根據(jù)滲透壓法測(cè)定相對(duì)(xiāngdu236。)的濃度。,滲透壓法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：裝置簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度相對(duì)高。,第九十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。s224。,擴(kuò)散系數(shù)D：在數(shù)值上等于(děngyd236。,第九十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。界面移動(dòng)的速度可以(kěyǐ)借助適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)系統(tǒng)來(lái)觀察。沉降系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)條件定為20?C,溶劑為水。xiě))來(lái)表示。,2. 沉降(ch233。ng)。,利用凝膠過濾可以把蛋白質(zhì)混合物按分子(fēnzǐ)的大小別離開來(lái),〔五〕凝膠過濾法測(cè)定(c232。tǐ)具有相同的過柱速度即相同的洗脫體積〔elution volume〕,那么認(rèn)為這種蛋白質(zhì)具有與此球體相同的半徑,稱蛋白質(zhì)分子的斯托克半徑。ng)的蛋白質(zhì),那么不能用此方法測(cè)定Mr。,第一百零三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。ngpǐn)亦可，只要找出活性峰位置〔Ve〕即可。ngxi224。oy236。nli224。ng)測(cè)定,凱氏定氮法：是經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)方法,但現(xiàn)在在生物學(xué)上已不多用。 Folin酚試劑法(Lowry法) ：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法。,二、 蛋白質(zhì)純度(chn)單一區(qū)帶。,5.N末端分析：N末端殘基只可能有一種氨基酸。,知識(shí)點(diǎn),蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)的沉淀方法 蛋白質(zhì)變性后的主要特征(t232。ng)總結(jié),蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及別離純化。依次洗脫收集后，通過(tōnggu242。蛋白質(zhì)分子量測(cè)定的主要方法,第一百一十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。粉末電泳：支持介質(zhì)是淀粉、纖維素粉或硅膠粉。(2) 細(xì)胞破碎：選擇適當(dāng)?shù)姆椒?將組織和細(xì)胞破碎。,內(nèi)容(n232。,蛋白質(zhì)等電點(diǎn) 等離子點(diǎn) 鹽析 鹽溶 蛋白質(zhì)的變性 復(fù)性 茚三酮反響 雙縮脲反響 層析 離子交換層析 凝膠過濾層析 親和層析 透析 電泳 SDSPAGE 等電聚焦(j249。,3.HPLC鑒定：純的多肽、蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出單一的對(duì)稱峰。)鑒定,1.電泳分析法：純的蛋白質(zhì)電泳只呈現(xiàn)(ch233。 Bradford法(考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法)：靈敏度高,能檢測(cè)μg級(jí)的蛋白。zh242。,一、 蛋白質(zhì)含量(h225。,第一百零七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,第一百零五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,(六) SDS －PAGE法測(cè)定相對(duì)(xiāngdu236。 chū)了一個(gè)經(jīng)驗(yàn)公式,①方法簡(jiǎn)便，儀器簡(jiǎn)單。,Gel filtration column,第一百零一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,注意：分子形狀為線形的或與凝膠能發(fā)生吸附作用(zu242。ng)相對(duì)分子質(zhì)量,洗脫過程,第九十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,第九十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。ng)平衡法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量,利用較低轉(zhuǎn)速〔8000~20000 r/min〕進(jìn)行(j236。,蛋白質(zhì)分子量與沉降系數(shù)的關(guān)系(guān x236。,大局部生物大分子的沉降系數(shù)介于11013到2001013秒的范圍。,如人血紅蛋白沉降系數(shù)s=4.46S，即4.4610－13秒。i)離心場(chǎng)的沉降速度。n s249。,第九十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。uys224。 fǒu)均一。nɡ y232。,R: 氣體常數(shù)； T：絕對(duì)溫度； ?：滲透壓； c: 溶質(zhì)(r243。nt242。)鐵原子如肌紅蛋白)可按下式計(jì)算出:,假設(shè)此蛋白含4個(gè)鐵原子(yu225。ng)最低相對(duì)分子質(zhì)量,用化學(xué)分析方法測(cè)定出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量,可以(kěyǐ)計(jì)算出蛋白質(zhì)的最低相對(duì)分子質(zhì)量。d236。n hu224。,第八十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。itǐ)外表。,(五) 利用與配體的特異(t232。n hu224。n hu224。)到層析柱上的蛋白質(zhì)的洗脫有不同的洗脫方式：,第七十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。ng)相〕填充到層析柱中。n)層析(P310),第七十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,填充(ti225。,是根據(jù)(gēnj249。zh237。)起來(lái)的電泳技術(shù)。,第六十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,等電聚焦(j249。,實(shí)際上是利用緩沖液在電場(chǎng)作用(zu242。,等電聚焦可以把人的血清分成40多個(gè)條帶。,蛋白質(zhì)混合物是在具有pH梯度的介質(zhì)〔如濃蔗糖溶液〕中進(jìn)行電泳的。,3.等電聚焦(j249。rng)蛋白質(zhì)就別離開了,第六十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。),第六十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置(zhuāngzh236。,第五十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。 分辨率高，尤其在不連續(xù)不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，有更高的分辨率。,聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)： 聚丙烯酰胺化學(xué)性能穩(wěn)定。n yǒnɡ),它以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板〔不連續(xù)(li225。n yǒnɡ)： 在支持物上電泳蛋白質(zhì)混合物,將其別離成假設(shè)干區(qū)帶,根據(jù)(gēnj249。r)產(chǎn)生折射率梯度，利用適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)系統(tǒng)〔見沉降速度法〕可以觀察到界面的移動(dòng)。)純化中的電泳,目前電泳的類型很多，但是它們都是在經(jīng)典的自由(z236。)原理分類,第五十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)。 等電聚焦(j249。,電泳(di224。nh232。,電泳的方向與速度與以下因素有關(guān)(yǒuguān)： ①電荷的正負(fù)性 ②電荷的多少 ③顆粒的大小與形狀。,電泳(di224。ndi224。)下進(jìn)行。)別離蛋