蛋白質(zhì)的分離純化概要-預(yù)覽頁
【正文】 中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，防止因長久放置造成制備物的分解破壞，這就是提取。通常采用類似生理條件下的緩沖液，如2050m mol/L的磷酸鹽緩沖液〔pH7.07.5〕或0.1mol/L TrisHCl〔pH7.58.0〕緩沖液作提取液。)純化,從細(xì)胞中提取得到的蛋白質(zhì)往往是不純(b249。,一、蛋白質(zhì)的別離(fēnl237。,主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開(fēn kāi)，這些方法的特點(diǎn)是簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。ngy232。,第十四頁，共六十一頁。qīng),球蛋白,清蛋白(d224。ndi224。,第十六頁，共六十一頁。 是極性有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，而使蛋白質(zhì)分子沉淀。 不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同，發(fā)生沉淀需要(xūy224。ngpǐn)經(jīng)粗制分級后，體積較小，雜質(zhì)大局部被除去。 另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)別離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。)測定,在酶的制備過程中，每一步驟(b249。u)后酶的回收率、純化倍數(shù)，從而決定這一步的取舍。)鑒定,生物大分子經(jīng)過別離提純，最后還要鑒定制品的純度。 純的蛋白質(zhì)在一定條件下進(jìn)行電泳，將以單一的速度移動，它的電泳圖譜只出現(xiàn)一條帶。,第五節(jié) 蛋白質(zhì)的層析別離,應(yīng)用廣泛。由于待別離的各種物質(zhì)在這兩個相分配系數(shù)不同，當(dāng)兩個相作相對運(yùn)動時，這些物質(zhì)在兩相間反復(fù)屢次分配，結(jié)果使其相互分開。,第二十三頁，共六十一頁。經(jīng)過5層的平衡(p237。如果D1，樣品集中在中間偏下。n)層析(IEX)是根據(jù)電荷來別離分子的。 蛋白質(zhì)分子是兩性物質(zhì)。n)層析,〔一〕根本原理,第二十五頁，共六十一頁。對多組分混合物，每種分子所帶的電荷不同，因此，可用不同的離子強(qiáng)度 或不同的pH溶液將蛋白質(zhì)從交換劑上一一洗脫下來。 suān)、弱堿幾種類型的離子交換劑。,第二十七頁，共六十一頁。i)較多。,離子交換纖維素 離子交換纖維素是以纖維素做支持介質(zhì)的?，F(xiàn)將常用的離子交換纖維素列于下表中。nɡ)的離子交換纖維素,離子(l237。,常用(ch225。,在Sephadex上接上某種離子交換基團(tuán)。葡聚糖凝膠離子交換劑的交換量比相應(yīng)的纖維素離子交換劑大，如DEAE—Sephadex的交換量大約是DEAE—纖維素的3.5～5.0倍。,葡聚糖凝膠離子交換(l237。,將各種離子(l237。 zǐ jiāo hu224。n)的選擇,離子交換劑的選擇 選擇離子交換劑之前要了解樣品的性質(zhì)：熱穩(wěn)定性、帶電情況(q237。實(shí)驗(yàn)室中最廣泛使用的是DEAE—和CM— 交換劑。,第三十七頁，共六十一頁。所用緩沖液的種類、pH大小，決定 待別離組分的穩(wěn)定性和溶解度。 zǐ jiāo hu224。n)劑時，要用陰離子型緩沖液〔磷酸、醋酸等〕；使用陰離子交換(l237。,要得到好的別離效果，層析時要注意層析柱的高度和體積；上樣量的大??；洗脫液體積；洗脫速度；分級物的收集量。離子交換層析所用的柱不用太長，以便縮短操作時間。pH和鹽濃度的改變又分為連續(xù)改變〔梯度洗脫〕和不連續(xù)改變〔階段洗脫〕 。,交換劑的處理就是將交換劑轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合別離目的的離子類型。h242。一般(yībān)總洗脫體積在500—2000ml時，每管收集5—10ml,〔五〕離子交換劑的處理(chǔlǐ)和再生,離子交換劑價格較貴，用后再經(jīng)過再生處理，可反復(fù)屢次使用。ishēng)條件,第四十一頁，共六十一頁。IgG可用QAE—Sephadex A—50或DEAE—Sephadex A—50別離。ng)實(shí)例,第四十二頁，共六十一頁。ng)其分子量。,凝膠層析載體是多孔凝膠。小分子向下移動的速度必然要落后于大分子。Kd由下式計算： Kd=(VeVo)/Vp 式中Ve為某種物質(zhì)從柱內(nèi)完全(w225。不同溶質(zhì)是按Kd由小到大的順序流出柱。o)的特征性常數(shù)。)，ρ必須大于或等于1。,第四十八頁，共六十一頁。,第五十二頁，共六十一頁。,第五十六頁，共六十一頁。,第六十頁，共六十一頁?；钚裕阂蟠蠓肿颖３痔烊粯?gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。h23
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