蛋白質(zhì)的分離純化概要-文庫(kù)吧
2024-11-04 05:31 本頁(yè)面
【正文】 來的天然狀態(tài)，防止因長(zhǎng)久放置造成制備物的分解破壞，這就是提取。,第九頁(yè)，共六十一頁(yè)。,蛋白質(zhì)的提取(t237。qǔ),大多數(shù)蛋白質(zhì)均能溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中，故蛋白質(zhì)的提取一般以水溶液提取為主。通常采用類似生理?xiàng)l件下的緩沖液，如2050m mol/L的磷酸鹽緩沖液〔pH7.07.5〕或0.1mol/L TrisHCl〔pH7.58.0〕緩沖液作提取液。 對(duì)于一些(yīxiē)和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽、稀堿、稀酸，常在提取液中參加適量的有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。,第十頁(yè)，共六十一頁(yè)。,第三節(jié) 蛋白質(zhì)別離(fēnl237。)純化,從細(xì)胞中提取得到的蛋白質(zhì)往往是不純(b249。 chn)的，含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步別離純化，這一階段可分為粗分級(jí)別離和細(xì)分級(jí)別離兩步進(jìn)行。,第十一頁(yè)，共六十一頁(yè)。,一、蛋白質(zhì)的別離(fēnl237。)純化,蛋白質(zhì)別離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。 性質(zhì) 方法 分子大小 透析、超濾、密度梯度離心(l237。xīn)、凝膠過濾 溶解度 等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀 電荷 電泳、離子交換層析 吸附性質(zhì) 吸附層析〔羥基磷灰石層析、疏水作用層析〕 對(duì)配體分子 親和層析 的生物親和力,第十二頁(yè)，共六十一頁(yè)。,主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開(fēn kāi)，這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。,粗分級(jí)別離,第十三頁(yè)，共六十一頁(yè)。,〔1〕鹽析(y225。n xī),向蛋白質(zhì)溶液(r243。ngy232。)中參加大量的中性鹽[〔NH4)2SO4，Na2SO4]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。 鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，鹽離子與水分子作用，使水的活度降低，原來溶液中大局部的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子外表的水化層，使蛋白聚集沉淀。同時(shí)鹽離子可以中和蛋白質(zhì)的外表電荷，也促進(jìn)蛋白的沉淀。,第十四頁(yè)，共六十一頁(yè)。,不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子外表(biǎomi224。n)的極性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：,血清(xu232。qīng),球蛋白,清蛋白(d224。nb225。i),(NH4)2SO4,50%飽和度,100%飽和,析出,析出,分段鹽析,第十五頁(yè)，共六十一頁(yè)。,〔2〕等電點(diǎn)沉淀(ch233。ndi224。n),蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關(guān)，隨溶液pH變化而變化。在溶液pH值等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小。 不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，因此通過調(diào)節(jié)溶液pH到目的蛋白的等電點(diǎn)，可使之沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開(fēn kāi)，從而除去大量雜蛋白。,第十六頁(yè)，共六十一頁(yè)。,〔3〕有機(jī)溶劑法,與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低(ji224。ngdī)。 有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有兩個(gè)： 降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子外表可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。 是極性有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，而使蛋白質(zhì)分子沉淀。,第十七頁(yè)，共六十一頁(yè)。,室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。假設(shè)預(yù)先將有機(jī)溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下將其逐漸參加蛋白質(zhì)溶液中，防止有機(jī)溶劑局部濃度過高，那么在很大程度上解決變性問題。 不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同，發(fā)生沉淀需要(xūy224。o)的有機(jī)溶劑濃度不同，因此可利用不同濃度的有機(jī)溶劑別離不同的蛋白質(zhì)。,第十八頁(yè)，共六十一頁(yè)。,細(xì)分級(jí)別離,一般蛋白質(zhì)樣品(y224。ngpǐn)經(jīng)粗制分級(jí)后，體積較小，雜質(zhì)大局部被除去。進(jìn)一步提純，通常使用高分辨率的柱層析及電泳方法。 常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析。 常用的電泳方法
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