【正文】 A對某些蛋白酶、磷酸酯酶和溶菌酶等有選擇性沉淀效果： ? PAA+酶 PAA酶 ↓ ? PAA酶 +Ca2+ PAACa ↓+酶 +2H+ ? PAACa ↓+SO42 CaSO4 ↓+PAA 五、等電點沉淀法 ? 等電點沉淀根據(jù)的原理是，蛋白質(zhì)的溶解度隨分子間引力增大而變小，當(dāng)其他條件相同時，分子間的引力在蛋白質(zhì)處于等電點狀態(tài)最大，因而容易沉淀析出。 ? 調(diào)整溶液的 pH時應(yīng)選用具有相同離子的酸或堿緩沖液。 雙相水溶液分離法 (aqueous twophase separation) ? 以聚乙二醇 (PEG)和右旋糖酐形成的兩相系統(tǒng)為例。 ? 把適當(dāng)?shù)哪z顆粒裝填成色譜柱，當(dāng)欲分離的物質(zhì)通過柱時，分子量不同的物質(zhì)在柱中的流動受到固定相的阻滯作用不同，分子量大的只能沿溶脹的凝膠顆粒間的空隙隨溶劑流動，移動速度較快，先流出柱外，分子量小的可滲入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流程長，移動速度慢，遲流出色譜柱。 ? 操作壓力： 50~700kPa， 超濾膜截留的顆粒直徑2~200nm， 相當(dāng)于分子量 1~500kD。超離心法只能處理小體積的試樣，主要用于病毒、細胞顆粒等的制備，對分子量較小的酶或蛋白質(zhì)分離效果一般不佳。對于后者，混合物隨流動相通過由吸附劑組成的固定相時由于 吸附劑對不同物質(zhì)的不同吸附力 而使混合物分離。 ? 正吸附：吸附所需要的蛋白質(zhì) ? 影響吸附、洗脫的的主要因素： ? pH 正吸附在較低的 pH下進行 負吸附可在較高的 pH及離子強度下進行 ? 離子強度 低鹽濃度有利于吸附 ? 蛋白質(zhì)濃度 1%以減少蛋白質(zhì)間的相互作用， 利于吸附。 ? 洗脫：通過控制 pH、 離子強度，使靜電引力下降。 ? 一般酶都要經(jīng)過多步的離交色譜、凝膠色譜等才能達到所要求的目的。 ? （二）等電聚焦 ? 在電解槽中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時，兩性電解質(zhì)即形成一個由陽極到陰極逐步增加的 pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)放進此體系時，不同的蛋白質(zhì)即移動到或聚集于與其相當(dāng)?shù)牡入婞c pH位置上，不再移動而達到分離的目的。 ? 一般電泳中，遷移率 m∝ q/f， q顆粒電荷，f摩擦系數(shù)。 ? 原理： ? 當(dāng)用特定的多緩沖液（ polybuffer,PB） I滴定和淋洗填裝在色譜柱中的特定多緩沖交換劑（ polybuffer exchanger,PBE） 時，隨著這種緩沖液的擴展，就會在色譜柱中自上而下建立起連續(xù)的 pH梯度，而該色譜柱中的蛋白質(zhì)也將隨 PB的擴展按各自的 pI聚焦于相應(yīng)的 pH區(qū)段，并隨擴展過程 pH梯度的逐漸下移而下移，最后分別從色譜柱先后洗出，達到分離純化的目的。 Pharmacia公司專門生產(chǎn)了相應(yīng)的產(chǎn)品。反之，選擇的 pH范圍如果高于被分離成分的等電點，則樣品將結(jié)合在柱上，需用鹽才能洗下。 ? 4. 樣品 ? 通常情況下不能含有大量的鹽，離子強度應(yīng)低于；樣品最好先用起始緩沖液平衡。 ? 洗脫液和體積和洗脫強度有關(guān)。 ? 比較簡單的辦法是將固體硫酸銨加入相應(yīng)的洗脫液組分中，使之達到 80%90%飽和度，放置 12h后讓蛋白質(zhì)完全沉淀，再離心分出。再生的交換劑可加 24%的乙醇防止微生物污染。對于酶的分離，配基可以是它的底物、輔助因子、底物類似物或競爭性抑制劑，通常它們都具有較高的親和力，能專一而可逆地形成酶 配基絡(luò)合物，親和關(guān)系愈專一，分離效果愈佳。 ? 第三，是柱長和大小 ? 最后是流速：不宜 10ml/ （三）洗滌和洗脫 ? 洗滌：為了除去非專一吸附的雜質(zhì)，通常的辦法是用平衡緩沖液或其它緩沖液淋洗。它的原理是，當(dāng)相應(yīng)的親和配基共價偶聯(lián)于電泳膠上后，等分離分析的成分將與配基發(fā)生親和作用，在電泳過程中不移動，而其他成分將按各自的電泳淌度分離開來。親和電泳法的分離量很小，主要用于分析，特別是用于進行解離常數(shù)的測定。 ? 酶在結(jié)晶時酶液應(yīng)達到一定的濃度和純度。 ? 方法：鹽析法，有機溶劑法，金屬離子復(fù)合結(jié)晶法，透析平衡結(jié)晶法，等電點結(jié)晶法，氣相擴散法， pH誘導(dǎo)法，溫度誘導(dǎo)法等。 酶的單位（ U） ? 酶的國際單位（ IU） ? 在最適反應(yīng)條件（溫度 25℃ ）下每分鐘催化 1摩爾底物變化所需要的酶量。s hydrophobic areas being strengthened causing the enzyme molecules to press and making them more resistant to thermal unfolding reactions. ? Not all salts are equally effective in stabilising hydrophobic interactions, some are much more effective at their destabilisation by binding to them and disrupting the localised structure of water. ? Ammonium sulphate and potassium hydrogen phosphate are a powerful enzyme stabilisers whereas sodium thiosulphate and calcium chloride destabilise enzymes. ? Many enzymes are specifically stabilised by low concentrations of cations which may or may not form part of the active site, for example Ca2+ stabilises aamylases and Co2+ stabilises glucose isomerases. ? At high concentrations (. 20% NaCl), salt discourages microbial growth due to its osmotic effect. ? In addition ions can offer some protection against oxidation to groups such as thiols by saltingout the dissolved oxygen from solution. Effect of ions on enzyme stabilisation ? increased chaotropic effect Cations Al3+, Ca2+, Mg2+, Li+, Na+, K+, NH4+, (CH3)4N+ Anions SCN, I, ClO4, Br, Cl, SO42, HPO42, citrate3 increased stabilisation ? Low molecular weight polyols (. glycerol, sorbitol and mannitol) are also useful for stabilising enzymes, by repressing microbial growth, due to the reduction in the water activity, and by the formation of protective shells which prevent unfolding processes. Glycerol may be used to protect enzymes against denaturation due to icecrystal formation at subzero temperatures. ? Some hydrophilic polymers (. polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone and hydroxypropylcelluloses) stabilise enzymes by a process of partmentalisation whereby the enzymeenzyme and enzymewater interactions are somewhat replaced by less potentially denaturing enzymepolymer interactions. They may also act by stabilising the hydrophobic effect within the enzymes. ? Important lessons about the molecular basis of thermostability have been learned by parison of enzymes from mesophilic and thermophilic anisms. A frequently found difference is the increase in the proportion of arginine residues at the expense of lysine and histidine residues. ? It should be noted that enzymes stabilised by making them more rigid usually show lower activity (. Vmax) than th