【正文】 11 酶的提取與分離純化 暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系 包惠燕 食品酶學(xué) 包惠燕 11 思考題 ? ？ ? ？ ? 中為什么要破細胞？破細胞的方法有哪些？其中哪些可用于大規(guī)模生產(chǎn)？ ? ？ ? 異？分別有哪些主要的分離方法？ ? 6. SDSPAGE指什么？試述其原理和應(yīng)用。 ? ，畫出示意圖。 本章主要內(nèi)容 ? 酶的提取、純化的基本原則 ? 細胞破碎 ? 酶的抽提 ? 濃縮與初步提純 ? 酶的分離純化方法 ? 酶的純化步驟 ? 酶純化步驟的定量評價 ? 酶的提純標準及劑型 11. 酶的提取、分離純化 酶的提取、分離純化是將酶從細胞或培養(yǎng)基中取出，再與雜質(zhì)分開，而獲得與使用目的、要求相適應(yīng)的有一定純度的酶產(chǎn)品的過程 ? 酶的提取包括以下內(nèi)容： ? 材料的選擇及前處理 ? 破細胞 ? 抽提 ? 濃縮與初步提純 酶的提取、純化的基本原則 一、防止變性失效 二、可以采用比一般蛋白質(zhì)分離更多更有效的方法和條件 三、提取、純化的每一步都應(yīng)進行酶活力的檢測 ? 采用的方法應(yīng)兼顧酶的回收和提高酶產(chǎn)品的比活力 注意點 ，所有操作都應(yīng)在低溫下條件下進行，尤其在有有機溶劑存在時更應(yīng)特別小心 2. 大多數(shù)酶在 pH4或 pH 10的情況下不穩(wěn)定，故必須控制整個系統(tǒng)不要過酸或過堿；同時要避免在調(diào)節(jié) pH時產(chǎn)生局部酸堿過量的現(xiàn)象。 ，常易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，故操作中應(yīng)盡量減少泡沫形成。 、有機溶劑等能使酶變性失效，微生物污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞，所有這些也都應(yīng)予以足夠的重視。 酶分離純化的工藝流程設(shè)計 設(shè)計時需要考慮的因素： ? 酶源材料 ? 前期工藝過程 ? 產(chǎn)品對純度的要求 ? 酶存在的狀態(tài) ? 設(shè)備條件 ? 動力、原料成本及工時費用 酶分離純化的工藝流程設(shè)計 ? 合理的工藝應(yīng)以降低成本，提高效能，同時又提高產(chǎn)品純度和質(zhì)量為前提。 ? 對一個方法好壞的評價標準是： ? ? 材料選擇及其前處理 ? 動物材料：事先剔除結(jié)締組織、脂肪組織 ? 植物材料：果實種子事先去皮殼，油質(zhì)種子用乙醚等脫脂 ? 微生物發(fā)酵物：先將菌體和發(fā)酵物分離 ? 胞外酶 酶 胞內(nèi)酶 結(jié)酶 溶酶 細胞破碎 除了動植物體液中的酶和微生物胞外酶之外，大多數(shù)酶都存在于細胞內(nèi)，因此提取和分離純化前須將進行細胞的破碎。 破碎細胞的方法有 : 機械法，物理法，化學(xué)法和酶法 機械破碎法 ? 指通過機械運動所產(chǎn)生的剪切力使細胞破碎的方法，常用的有如下幾種： ? ? 利用搗碎機的高速旋轉(zhuǎn)葉片所產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎。 10000r/min ? 此法在實驗室和生產(chǎn)規(guī)模均可采用。 ? ? 利用研缽、石磨、球磨 (不銹鋼或玻璃珠直徑 )、細菌磨等研磨器械所產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎，必要時可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化鋁等作為助磨劑。 ? 此法效率較低 機械破碎法 ? ? 利用勻漿器所產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎。勻漿器一般由硬質(zhì)磨砂玻璃制成，也可由硬質(zhì)塑料可不銹鋼等制成。通常用來破碎那些易于分散，比較柔軟，顆粒細小的組織細胞。 ? 此法細胞破碎程度較高，對酶的破壞也較少，但難于在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。 物理破碎法 ? 通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，使組織細胞破碎的方法，統(tǒng)稱為物理破碎法。此法多用于微生物細胞的破碎 ? 通過溫度的突然變化使細胞破碎。 ? 例如將冷凍的細胞突然放進較高溫度的水中，或?qū)⑤^高溫度中的細胞突然冷凍都可使細胞破壞。 ? 此法對較脆弱的細胞效果較好。但難以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。 ? 通過壓力的變化使細胞破碎。常用的有高壓沖擊、突然降壓和滲透壓差法等。 ? （ 1）高壓沖擊法是在結(jié)實的容器中裝入菌體細胞和冰晶、石英砂等混合物，用活塞或沖擊錘加高壓沖擊之，使細胞破碎。沖擊壓力可達每平方厘米幾百至幾千 kg。 MantonGaulin homogeniser valve 壓力差破碎法 ? （ 2）突然降壓法是將菌體裝進高壓容器中，加壓至 30MPa以上，打開出口閥，使菌體懸浮液經(jīng)閥門流出，出口處壓力突然降為常壓，由于膨脹而使細胞破碎。 ? 突然降壓法的另一種形式為爆破性減壓法是將菌體懸浮在高壓容器中，用氮氣或二氧化碳加壓到幾十至幾百大氣壓，振蕩幾分鐘，使氣體擴散到細胞內(nèi)，然后突然排出氣體，壓力驟降，使細胞破碎。 壓力差破碎法 ? （ 3）滲透壓差法是利用滲透壓的變化而使細胞破碎。 ? 應(yīng)用時先將對數(shù)生長期的細胞從培養(yǎng)液中分離出來，再懸浮在 20%左右的蔗糖溶液中平衡一段時間，然后離心收集細胞，迅速投入 4℃ 左右的蒸餾水或低滲溶液中。由于細胞外滲透壓突然降低，而使細胞破碎，將細胞中的酶等物質(zhì)釋出胞外。 ? 此法適用于膜結(jié)合的酶、細胞間質(zhì)酶等的提取?？捎糜趶暮Ｑ笪⑸镏刑崛∧承┟?。但對 G+菌不適用。 ? 利用超聲波的機械振動而使細胞膜上所受張力不均而破碎。 Fig. Sonicator 化學(xué)破碎法 ? 這是應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細胞膜作用，使細胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或破壞的方法。 ? 常用的試劑可分為有機溶劑和表面活性劑兩大類。 （ 1）有機溶劑處理 ? 有機溶劑可使細胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細胞膜的透過性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋出胞外。 ? 常用的有機溶劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。 （ 2）表面活性劑處理 ? 表面活性劑可以和細胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使細胞結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的透過性。 ? 在酶的提取方面一般采用非離子型的 Triton、Tween等表面活性劑。 ? 表面活性劑處理對膜結(jié)合酶的提取特別有效，在實驗室和生產(chǎn)中均已成功使用。 酶學(xué)破碎法 ? 在一定條件下，通過外加的酶或細胞本身存在的酶的作用，使細胞破碎。 ? ? 根據(jù)細胞外層結(jié)構(gòu)特點，選用適當?shù)拿?，使細胞壁破壞，并在低滲透壓的溶液中使細胞破裂。 ? 如溶菌酶能專一作用于肽多糖的 β1， 4糖苷鍵，常用于 G+ 菌的細胞破碎。 ? β葡聚糖酶用于酵母細胞的破碎。 ? 幾丁質(zhì)酶用于霉菌的細胞破碎 ? 纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶往往混合使用，作用于植物細胞的細胞壁。 ? 將細胞在一定的 pH值和適宜的溫度條件下保溫一段時間，通過細胞本身存在的酶系將細胞破壞，使胞內(nèi)物質(zhì)釋出的方法稱為自溶法。 ? 必要進可加入甲苯、氯仿、疊氮鈉等殺菌劑 ? 此外可通過加入噬菌體去感染細胞，或通過電離輻射等方法，使細胞自溶。 丙酮干粉的制備 ? 破細胞等處理后可將材料制成丙酮干粉 (acetone powder)， 一般程序是： ? 先將材料粉碎、分散，然后在 0℃ 以下的低溫條件下，加入 5~10倍預(yù)先冷至約 20 ℃ 的丙酮，迅速攪拌均勻，隨即過濾，最后低溫干燥，研磨過篩。丙酮處理一方面能有效地破壞細胞壁，另一方面有利于除去大量的脂類雜質(zhì)，同時還能使某些膜結(jié)合酶易于溶解。此外，丙酮干粉含水量低，便于保存。 酶的抽提（萃取、提?。? ? 酶的抽提是指在一定條件下，用適當?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程。 ? 抽提的要求是將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料引入溶液。 ? 酶抽提時首先應(yīng)根據(jù)酶的性質(zhì)和溶解性質(zhì)，選擇適當?shù)某樘嵋?。抽提液的具體組成和抽提條件取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及有利于切斷酶和其他物質(zhì)的聯(lián)系。 抽提劑 ? 由于大多數(shù)酶屬于球蛋白類，一般都溶于稀鹽、稀酸或稀堿溶液。但抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及如何最有利于切斷酶和其他物質(zhì)的聯(lián)系。 抽提劑的組成 ? 破碎生物組織一般在適當?shù)木彌_液中進行，典型的抽提劑由以下幾部分組成： ? 離子強度調(diào)節(jié)劑（如 KCl, NaCl,蔗糖） 最普通的有~， 。 ? pH緩沖劑 通常以選用 pH4~6為佳 ? 溫度效應(yīng)劑 (如甘油，二甲亞砜 ) ? 蛋白酶抑制劑（如 PMSF苯甲磺酰氯， DIFP二異丙基氟磷酸） ? 防氧化劑 (如巰基乙醇） ? 重金屬絡(luò)合劑（如 EDTA， 檸檬酸） ? 增溶劑（如 TritonX100,去氧膽酸鹽） 濃縮與初步提純 ? ? 抽提液和發(fā)酵液中的酶的濃度一般都很低，所以在純化前往往須先加以濃縮。沉淀法可濃縮并去除部分雜質(zhì)，此外，濃縮的方法有 ? （ 1）蒸發(fā)法 ? （ 2）反復(fù)凍融法 ? （ 3）膠過濾 ? （ 4）超濾法 ? 除去大分子的核酸和粘多糖 ? （ 1）加硫酸鏈霉素、聚乙烯亞胺、魚精蛋白或MnCl2可使核酸沉淀移去。必要時使用核酸酶。 ? （ 2）常用醋酸鉛、乙醇、單寧和離子型表面活性劑等處理解決，有時也用酶。 ? 經(jīng)過初步提純，余下來的大分子為酶與雜蛋白，分離純化的主要工作，同時也是比較困難的工作，就是將酶從雜蛋白中分離出來。 酶的分離純化方法 ? 現(xiàn)有的酶的分離純化方法都是根據(jù)酶和雜蛋白在下列性質(zhì)上的差異建立的。 ? 性質(zhì) 方法 ? 分子大小 離心，超離心法、凝膠過濾， 膜分離技術(shù)（超濾，反滲透，