質(zhì)粒的提取和鑒定,dna酶切(已修改)
2025-06-07 18:28 本頁(yè)面
【正文】 堿變性法小量提取質(zhì)粒， DNA的限制性酶切 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)組 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 掌握堿變性法提取質(zhì)粒 DNA的方法。 ? 掌握質(zhì)粒酶切鑒定原理 , 學(xué)會(huì)根據(jù)目的基因和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適載體與限制性內(nèi)切酶，設(shè)計(jì)構(gòu)建體外重組分子。 質(zhì)粒 (plasmid) ? 是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器 （主要指線粒體和葉綠體） 和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的 DNA分子，在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。 ? 是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器 （主要指線粒體和葉綠體） 和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的 DNA分子，在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。 分離質(zhì)粒 DNA的 基本步驟 ? 培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增； ? 收集和裂解細(xì)菌； ? 分離和純化質(zhì)粒 DNA 質(zhì)粒 DNA的提取方法 ? 堿變性法（堿裂解法）； ? 煮沸裂解法； ? 羥基磷灰石柱層析法； ? 質(zhì)粒 DNA釋放法； ? 酸酚法等。 堿變性（ 裂解） 法基本原理： 在堿性條件下（ pH ），染色體 DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒 DNA氫鍵也大部分?jǐn)嗔?，雙螺旋也有部分解開，但共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以 pH pH調(diào)到中性時(shí)，變性的質(zhì)粒 DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，而染色體 DNA不能復(fù)性，形成纏繞的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離心后，由于浮力密度不同，染色體 DNA與大分子 RNA、蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。 原理示意圖 質(zhì)粒 DNA電泳 電場(chǎng)中 DNA分子的遷移速度取決于： ? DNA分子本身的大小 ? DNA分子的空間構(gòu)型 – 超螺旋構(gòu)型（ ccDNA) – 線形 DNA(lDNA) – 開鏈環(huán)狀 DNA(ocDNA) – 復(fù)制中間體（沒有復(fù)制完的兩個(gè)質(zhì)粒連在一起 ) ?溴化乙錠（ EB）是一種熒光染料 (3,8二氨基5乙基 6苯基菲啶溴鹽 )，其分子可以嵌入到核酸的堿基對(duì)之間，在紫外線的激發(fā)下，發(fā)出橙色熒光 Attention, please! ? EB是強(qiáng)誘變劑，配制和使用 EB染色液時(shí)，應(yīng)帶乳膠手套或一次性手套，并且不要將該染色液灑在桌面或地面上，凡是沾污 EB的器皿或物品，必須進(jìn)行清洗或棄去！ 質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)材料與試劑 ? 實(shí)驗(yàn)材料： 過夜培養(yǎng)大腸桿菌 DH5a ? 實(shí)驗(yàn)試劑： – LB培養(yǎng)基 NaCL、 10mM （ ）、1mM EDTA、 Amp 50mg/ml、酚、氯仿、 Rnase、瓊脂糖 – TE： 10mM （ ）， 1mM EDTA – 溶菌酶 10mg/ml（用 10mM ， ，新鮮配制） ? 溶液 Ⅰ —溶菌液： 50mM 葡萄糖， 25mM （ ）， 10mM EDTA， 2mg/ml 溶菌酶。 ? 溶液 Ⅱ — NaOHSDS液： NaOH， 1% SDS。 ? 溶液 Ⅲ — 3mol/L NaAc（ ）溶液： 5M KAC 10ml，冰醋酸 ，水 。 步驟 一 細(xì)菌培養(yǎng)與質(zhì)粒擴(kuò)增 1. 挑單克隆 4ml LB培養(yǎng)液中（含 Amp 50181。g/ml）， 37 ℃ 225rpm振蕩 培養(yǎng)過夜。 （活化菌種） 2ml種子菌液于含 Amp培養(yǎng)基 500ml中， 37℃ 振蕩培養(yǎng) 34小時(shí)（ OD600＝ ） 4ml培養(yǎng)液至 Eppendorf管中， 12022 rpm， 4 ℃ 離心 30秒，棄上清，用 1ml STE懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復(fù)一次，棄上清，取沉淀。 步驟二 質(zhì)粒提取 1. 取 4ml培養(yǎng)物至 Eppendorf管中， 1
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