dna和rna的提取與純化(已修改)
2025-05-27 21:22 本頁面
【正文】 第四章 基因工程的主要技術及其原理 第一節(jié) DNA和 RNA的提取與純化 制備純的高分子量的 DNA 是基因工程操作的基礎之一 一、 DNA提取的基本原理與方法 化學性質 比較穩(wěn)定 潛在的反應基團隱藏在中央螺旋內，并經氫鍵緊密連接。它的堿基對外側受磷酸和糖形成的強大環(huán)層的保護，這種保護因內在的堿基堆積力而進一步加強。 1. DNA的性質： 核苷 核苷酸 堿基 高分子質量 DNA長而彎曲，僅具有極微的側向穩(wěn)定性，因而容易受到最柔和的流體剪切力的傷害。雙鏈 DNA在溶液中隨機卷曲，并由于堿基堆積力和 DNA骨架上磷酸基團間的靜電排斥力而變得黏滯。 由吸液，振蕩，攪拌所導致的水流對黏滯的盤繞物產生拖拉力，能切斷 DNA的雙鏈。 DNA分子越長，斷裂所需的力越弱。因此，基因組 DNA容易成片段地獲得，所需分子質量越大，獲得的難度也相應增加。 物理性質 2. 天然 DNA的來源和用途 ? 天然 DNA包括染色體 DNA,病毒 DNA(噬菌體DNA),質粒 DNA,線粒體及葉綠體 DNA等 ,可從不同的生物體中提取 . ?染色體 DNA. 其分子巨大 ,可長達 106kb,小的也有 1000kb左右 .是生物界含量最豐富的 DNA資源 ,蘊藏著地球上極大部分的遺傳信息 . 是分離目的基因和基因表達調控因子的主要材料 ,也可提供構建染色體載體和染色體基因整合平臺系統(tǒng)之用 . ?病毒和噬菌體 DNA. 含 DNA的病毒和噬菌體的種類很多 ,能在相應的原核生物和真核生物宿主細胞內大量增殖 .由于此類 DNA可被體外包裝 ,所以主要用于構建基因克隆載體 ,承載較大片段的外源DNA,經體外包裝 ,導入受體細胞 .此類 DNA也編碼一些結構基因 ,可作為分離目的基因和基因表達調控因子的材料 . ?質粒 DNA 很多微生物細胞內含有質粒 DNA,游離于細胞質中 ,所以被稱為染色體外遺傳物質 .每種質粒都有復制起始位點 ,能自我復制 .主要用于構建載體 .也要用于分離目的基因和基因表達調控因子 . ?線粒體和葉綠體 DNA. 真核生物特有的染色體外遺傳物質 ,分別含有與呼吸作用和光合作用有關的基因 .可用于分離目的基因及構建載體 不同生物（植物、動物、微生物）的基因組 DNA的提取方法有所不同 。 不同種類或同一種類的不同組織因其細胞結構及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時必須參照文獻和經驗建立相應的提取方法， 以獲得可用的 DNA大分子。 （一） DNA提取的基本原理 DNA分子是極性分子，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，其鈉鹽比游離太更易溶于水。 酸性溶液中， DNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。 生物細胞中大部分 DNA集中在細胞核，多以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在。而 DNP在鹽溶液中的溶解度受鹽溶液濃度的顯著影響， mol/L NaCl溶液中最低，僅為水中溶解度的 1%，濃度升高，溶解度增加，到 1 mol/L時，比純水高 2倍。而核糖核蛋白 (RNP)在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在 mol/L NaCl的溶解度較大。據此，可分享 DNP和 RNP. 一般 DNA提取都分為兩步，即先是溫和或機制裂解細胞及溶解 DNA，接著采用幾種化學和酶學方法中的任一種， 以去除蛋白、 RNA及其它的大分子。 1生物材料的準備 選用的材料應該是處于提取 DNA得率最高的生長期 ,或者是DNA容易提取和含量高的組織 .對于細菌 ,一般取對數(shù)生長后期 .對于植物一般取幼嫩的植株 ,并且暗培養(yǎng) 12天 ,甚至黃化苗 .提取動物肝臟 DNA應清除膽囊 ,因其含有多種高活性酶 . 2細胞的裂解和 DNA的溶解 細胞不裂解 ,則 DNA釋放不出來 .裂解不完全 ,得率就低 .如果細胞裂解過于激烈 ,會導致 DNA的斷裂 .裂解方法因物種而異 . 對于原核生物 ,可用溶菌酶處理 .用 NaOH,SDS,用煮沸及冰凍 ,超聲波處理等方法使細胞裂解 . 對結構復雜的動植物材料要進行磨樣 (粉碎 )。一般方法是將材料放入研缽（放在冰中預冷），加入液氮，快速磨碎成粉狀。然后再參照裂解原核生物細胞的方法裂解細胞 . 一般用 SDS、 CTAB、溶菌酶和蛋白酶 K來裂解細胞。 所用緩沖液一般為 TE（ TrisCHCl EDTA）緩沖液。 提取緩沖液： 100mmol/L Tris Cl(),50mmol/L EDTA (),500mmol/L NaCl,10mmol/L α巰基乙醇。 在提取時，將 10％ SDS加入緩沖液中于 65℃ 預熱一定時間。然后加入到裝有樣品的離心管中，于 65℃ 保溫 60－ 90min。其間輕輕搖動數(shù)次。 4℃ 下 12021rpm離心 10min,將上清轉入另一離心管中 ,上清即為DNA的粗提物。 正常條件下，由于細胞的區(qū)室化隔離， DNA酶，氧化酶等分布于特定 區(qū)隔中，不與 DNA接觸。細胞破碎，則容易導致 DA N降解。 因此提取過程中對 DNA 的保護顯得非常重要。 措施： （１）利用液氮超低溫下研磨，減少損失。 （２）快速加入緩沖液并迅速混勻，對細胞溶漿中 DNA進行保護。 加入 EDTA和抗氧化劑及 PVP等 3核酸的純化 主要根據核酸的性質 ,使其與細胞內其它成分分離開來 ,從中進一步抽提 DNA.（ 雜質的去除 ） 核酸通過有機溶劑抽提并進行純化 。 污染的 RNA通過RNase消化清除 。 在粗提物中加入等體積的氯仿／異戊醇 （ 或酚／氯仿／異戊醇 ） 輕輕顛倒混勻 ， 12021rpm離心 5min， 上清液為DNA的水溶液
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