dna和rna的提取與純化(參考版)
2025-05-15 21:22本頁面
【正文】 方法：取 2μg DNA, 用 10單位 (U)HindⅢ 酶切過夜 , % agarose膠上電泳 , 檢測能否完全酶解 。 在抽提質粒 DNA過程中，由于各種因素的影響， 使超螺旋 (SC)的共價閉合環(huán)狀結構的質粒 DNA的 一條鏈斷裂，變成開環(huán)狀 (OC)分子，如果兩條鏈 發(fā)生斷裂則形成線狀 DNA(L)分子 . 三種構型的分子有不同的遷移率，在一般情況下， 超螺旋型分子遷移速度最快，其次為線狀分子，最 慢的為開環(huán)狀分子。 （ 不常用 ， 如需要可查 《 分子克隆 》 ） 3 DNA質量的電泳測定 在一般分子標記試驗時要通過瓊脂糖電泳結合分光光度分來對DNA質量進行檢測 。 OD260／ OD230小于 ， 表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質 。 RNA樣品 OD260／ OD280的比值小于 ， 說明有蛋白質或苯酚污染 。 OD260／ OD230 小于 ， 表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質 ， 如核苷酸 、 氨基酸 、 酚等 。 對于 DNA制備 ， 如果OD260／ OD280大于 RNA污染 。 純度： DNA和 RNA純制品的 OD260： OD280值分別為 和 ， 若樣品中蛋白或酚的污染嚴重則 OD260： OD280較低 。該方法僅在很窄的濃度范圍內可靠（ 5－ 90μl/ml）。 由于 DNA和 RNA的比吸光系數(shù)均受溶液中離子強度和PH值的影響，因此只有在仔細控制 PH值且離子強度較低時才能測定準確。 其原理是由于核酸是在 260nm處有強吸收的化合物 。 三 、 核酸濃度純度和相對分子質量的測定 廣泛用于測定制備物中核酸的質量的方法有兩類。 最大的優(yōu)點是操作快 ， 配體結合僅需幾分鐘 ， 磁力分離只需幾秒鐘 ， 洗滌和洗脫在大多數(shù)時候僅需 5min或更短的時間完成 。 最后 ， 用水將poly(A)+mRNA 從磁珠上洗脫 ， 用乙醇沉淀收集 。 在典型的實驗中 ， 組織 、 細胞或細胞懸液用硫氰胍裂解 ，將帶生物素的 oligo（ dT） 引物直接加入裂解液 ， 放置一段時間 ， 使引物與細胞 mRNA poly(A)尾雜交 ， 然后加入交聯(lián)抗生素蛋白鏈菌素的磁珠 。有柱層析的方法和批量層析兩種。 真核生物 mRNA的分離 （ 1)得到總 RNA后， 可用 oligo(dT)纖維素層析法提取mRNA[poly(A)+RNA ]. 其原理是大多數(shù)真核 mRNA 3’端帶有足夠長的多聚腺苷酸殘基，可通過其與掛有寡聚 d(T)的纖維素親和形成穩(wěn)定的 RNA－ DNA雜合鏈，不含 polyA的 RNA從介質中洗去后，應用低鹽緩沖液解離雙鏈結構，并從介質中洗脫poly(A)+RNA, 從而使 mRNA得以純化。 ?mRNA是蛋白質生物合成的模板。端有PolyA。端有一段帽子結構 （ m7GpppNmpNmp） ； 3) 原核 mRNA 339。 也呈莖環(huán)結構 大腸桿菌 5S rRNA 的二級結構模型 rRNA分子 大腸桿菌 5S rRNA 的三級結構模型 rRNA分子 mRNA分子 原核生物和真核生物的 mRNA在結構上有所不同： 1) 原核生物的 mRNA是多順反子的 ， 真核生物的mRNA是單順反子的； 2) 原核 mRNA 539。 ?合成蛋白質的場所。 rRNA分子 — 結構特點 ?與蛋白質結合，組成大小亞基。端都為 pG ?有較多的修飾成分 tRNA分子 ?反密碼環(huán)由 7個核苷酸組成，有 3個反密碼子 ?可變環(huán)，由 318核苷酸組成 ?二氫尿嘧啶 (D環(huán) ) tRNA分子 ?TψC (ψ 為假尿苷 ) tRNA的三級結構 倒 L型 ： 一端是 — CCA， 另一端是反密碼子環(huán) 。 ?339。端都為 pG ? 有十幾個恒定的核苷酸，對于維持其空間結構和實現(xiàn)生物功能起重要作用 tRNA分子 ?AU， GC堿基對雙螺旋區(qū)為臂，其它區(qū)域為環(huán)。 ?339。 ?有較多的修飾成分 ?AU， GC堿基對雙螺旋區(qū)為臂，其它區(qū)域為環(huán)。 ? 離心分離法 利用 RNA吸附硅膠或玻璃質離心管代替有同溶劑提取步驟 ， 可避免有機溶劑的損傷 。 該法所提 RNA純度高 ,完整性好較適合純化 mRNA， 逆轉錄及構建 cDNA文庫 ， 因此為大多數(shù)人采用 。 RNA的貯存 用去離子甲酰胺溶解并貯存于－ 20℃ 。 （ ２ ） 直接在酸性條件下酚－氯仿混合液抽提 ， 低 pH的酚將 使 RNA進入水相 ， 使其與仍留在有機相中的蛋白質和 DNA分開 。 ? 有效的抑制 RNA酶的活性 ? 將 RNA和 DNA、 蛋白質和多糖分開 。 由于可以被抽提用的苯酚除去 ， 所以在純化過程中需補充幾次抑制劑 。 由于它們不能在變性劑如 SDS和胍存在時使用 ， 所以在裂解細胞時 ， 不能加此類蛋白 。 ? RNA酶的蛋白質抑制劑 這類蛋白質可以與 RNA酶非共價的結合 ， 形成復合物從而使 RNA酶失活 。 因為該復合物不能共價修飾 RNA酶 ， 因此在提取純化 RNA的各個步驟中都必須應用 。用來滅活緩沖液和玻璃器皿中的 RNA酶。 （ 2） 在分離 RNA的過程中 ， 用 抑制劑以抑制 RNA酶的活性 。 為了減少污染的機會， 當從原包裝取出這些小的器具放到實驗室架子上時最好用無菌的鑷子 。 ? 進行 RNA操作時 ， 為了防止 RNA酶 ， 所采取的措施包括： （ 1） 儀器和緩沖液專用 ， 如移液器 ， 電泳槽 、 玻璃器皿 、 塑料制品和緩沖液 。 （ 2） 移
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