質(zhì)粒dna提取純化與驗(yàn)證(參考版)
2025-06-22 05:09本頁(yè)面
【正文】 能干的人，不在情緒上計(jì)較，只在做事上認(rèn)真；無(wú)能的人！不在做事上認(rèn)真，只在情緒上計(jì)較。什么是奮斗？奮斗就是每天很難，可一年一年卻越來(lái)越容易。寧可累死在路上，也不能閑死在家里！寧可去碰壁，也不能面壁。質(zhì)粒電泳過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)重要試劑及操作步驟的意義和作用。無(wú)水乙醇和鹽溶液可使溶于上清液中的質(zhì)粒DNA凝聚而形成沉淀，其中鹽溶液的作用是中和DNA所帶的負(fù)電荷，使DNA之間的排斥力減小，有助于DNA的沉淀。苯酚/氯仿/異戊醇混合液的作用:苯酚是強(qiáng)的蛋白阻斷劑，可使蛋白變性；氯仿也是蛋白阻斷劑，但強(qiáng)度弱于苯酚，其主要作用是將同水以極小比例互溶的苯酚萃取出來(lái)?；煸谫|(zhì)粒DNA中的RNA會(huì)用RNase除去。同時(shí)含有EDTA是二價(jià)陽(yáng)離子的螯合劑，抑制DNA酶作用。因?yàn)槿芤孩蠹尤牒螅?jīng)計(jì)算可知Na+的濃度為1 M，又Na+，所以該處沒(méi)有添加Na+。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。冰乙醇作用：用無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。該步反應(yīng)形成的高鹽環(huán)境進(jìn)一步加速了這一沉淀。 HAc中和NaOH，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件下會(huì)打斷基因組DNA，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒(méi)有辦法再被PDS共沉淀了。溶液Ⅲ的作用： 十二烷基硫酸鈉（SDS sodium dodecylsulfate）遇到KAc后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。溶液Ⅱ的作用：NaOH使細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化導(dǎo)致細(xì)胞溶解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，可抑制DNase的活性，抑制微生物的生長(zhǎng)?！舅伎肌抠|(zhì)粒提取過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)重要試劑及操作步驟的意義和作用。染色體DNA和雙鏈開(kāi)環(huán)DNA含量少，蛋白質(zhì)含量相對(duì)多一些。本組中，均加過(guò)RNA酶，RNA分解比較徹底，僅在100bp左右有一條很模糊的帶。而開(kāi)環(huán)DNA空間位阻最大，所以跑得最慢。在瓊脂糖凝膠電泳中不同構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA,盡管分子量相同，但具有不同的電泳遷移率。正常情況下，由于沒(méi)有專門(mén)的限制酶切割DNA分子，所以線性DNA分子比較難形成。3）三種構(gòu)型質(zhì)粒DNA條帶： 在4361bp至2000bp條帶間可以看到兩條帶：上面一條顏色很淺，條帶大小在4300bp左右，為開(kāi)環(huán)DNA分子；下面一條顏色很亮，條帶大小接近1900bp，與第三泳道的PUC19位與同一水平，為超螺旋DNA分子。2）染色體DNA條帶：在點(diǎn)樣孔至23130bp的條帶間可以觀察到微弱的條帶，其條帶位置同樣與14泳道的λDNA相近，該條帶代表的是殘留的染色體DNA。電泳時(shí)，由于蛋白質(zhì)分子較大，很難通過(guò)瓊脂糖分子篩，所以殘留在點(diǎn)樣孔處。質(zhì)粒DNA提取過(guò)程中，染色體DNA、蛋白質(zhì)、RNA等物質(zhì)仍有部分殘留，質(zhì)粒DNA有超螺旋、開(kāi)環(huán)、線性三種不同的狀態(tài)，這些因素導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組中每種樣品都可以觀察到多條帶。其中，λ/Hind III DNA Maker可由HindI II酶切Lambda后得到的，本應(yīng)有8條帶，最后一條帶大小約為125bp,實(shí)驗(yàn)中一般很難觀察到；DL2000 DNA Marker是由單獨(dú)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合而成，包括6條DNA條帶，其DNA片段相比λ/Hind III DNA Maker要小，適用于比對(duì)較小的DNA片段。（二）凝膠電泳結(jié)果從左至右各泳道的樣品及上樣量泳道12345…121314151617樣品λ/HindIIIpUC19/ HindIIIpUC19(商品)JD1JD2…JD9JD10λDNAJD5()JD7()DL2000樣量（181。 電泳時(shí)可以明顯觀察到藍(lán)色條帶在電泳槽里由負(fù)極向正極移動(dòng)，這是因?yàn)镈NA雙螺旋分子骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】（一）實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象及數(shù)據(jù)記錄滅菌干燥離心管質(zhì)量： m1=； 菌液離心后離心管質(zhì)量： m2=； 菌體質(zhì)量： W=；
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