dna和rna的提取與純化(編輯修改稿)
2025-06-16 21:22 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 如與密度梯度中某一位置的 CsCl濃度相符，大 分子物質(zhì)就會準確地漂浮在這一位置上 . 離心管中 CsCl起始溶液的密度通常要進行調(diào)整 ,使其與有待研究的 分子或顆粒的密度相對應。 如多數(shù)雙鏈線狀 DNA分子的浮力密度約為 ,形成梯度 的 CsCl溶液的起始密度應為 1氯化銫密度梯度離心法 細胞裂解及ＤＮＡ分離過程中，大分子量的細菌染色體ＤＮＡ容易發(fā)生斷裂形成相應的線性片段，而質(zhì)粒 ＤＮＡ則由于其分子量較少，結(jié)構緊密，所以仍保持完整狀態(tài)。根據(jù)此差別進行密度梯度離心純化。 利用在濃縮的鹽溶液中，溴化乙錠（ EB)扁平分子在ＤＮＡ堿基對之間的嵌入作用。 染色體ＤＮＡ分子線性片段具有游離的末端而易于解旋，可結(jié)合大量的 EB分子。而質(zhì)粒的共價閉合環(huán)狀的 ＤＮＡ分子，由于沒有游離末端，只能發(fā)生有限的解旋反應，結(jié)合ＥＢ分子的數(shù)量少。ＤＮＡ分子結(jié)合ＥＢ數(shù)量越多，則密度越小。密度梯度離心后，處于不同的位置，從而達到純化質(zhì)粒ＤＮＡ之目的。 2堿變性抽提法 染色體 DNA為線性 DNA分子，質(zhì)粒 DNA為超螺旋共價閉合環(huán)狀 DNA. 根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒ＤＮＡ與線性染色體ＤＮＡ片段之間 在拓撲學的差異而發(fā)展出來的。 通過加熱，尤其在 pH值介于 ，線性的 ＤＮＡ會被變性，而 cccDNA則不會變性。 即根據(jù)染色體 DNA與質(zhì)粒 DNA的變性與復性的差異而達 到分離目的。 變性處理過的質(zhì)粒和染色體ＤＮＡ混合物，通過致冷或恢復中性 pH，便會迅速地復性。在復性過程中，兩種構型的分子，其雙鏈再結(jié)合的精確性有本質(zhì)上的差別，所以復性快而準確。而隨機斷裂產(chǎn)生的線性的染色體ＤＮＡ分子，彼此已經(jīng)分離開來的互補鏈之間的復性作用就不會迅速。常聚集成網(wǎng)狀結(jié)構，通過離心分離便會與變性的蛋白質(zhì)及ＲＮＡ一道沉淀下來。從而分離。 堿變性法一般要用到三種溶液即 : 溶液 I， 50 mM葡萄糖 /25 mM TrisCl / 10 mM EDTA， pH ； 葡萄糖最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部 EDTA，是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉 . TrisCl 控制溶液的 pH 溶液 II， 新鮮的 N的 NaOH和 1％的 SDS等體積混合 ； 新鮮的 NaOH,是為了保證 NaOH沒有吸收空氣中的 CO2而減弱了堿性 這一步要注意 : 第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂； 第二，必須溫柔混合，不然基因組 DNA也會斷裂。基因組 DNA的斷裂會帶來麻煩 . 這其實是十二烷基硫酸鈉（ sodium dodecyl sulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（ potassium dodecylsulfate,PDS），而 PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀 . SDS專門和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個 SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，同時大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。 2M的醋酸是為了中和 NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷 DNA，所以要中和之?；蚪M DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是 50－ 100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被 PDS共沉淀了 . 溶液 III， 3M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。 溶液 III加入后就會有大量的沉淀 . 3影響質(zhì)粒ＤＮＡ產(chǎn)量的因素 使用 endA基因突變的菌株，失去了合成具有功能活性的 核酸內(nèi)切酶１能力，從而增進所含有的質(zhì)粒ＤＮＡ分子 的穩(wěn)定性。 理論產(chǎn)量 =質(zhì)?？截悢?shù) *分子量大小 *每亳升培養(yǎng)液中的大腸桿菌細胞總數(shù) ?RNA性質(zhì)與結(jié)構 核糖核酸。 因為核糖殘基在 2’ 帶有羥基 , 所以 RNA比 DNA的化學性質(zhì)活躍 , 易被污染的 RNA酶（具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵能力的酶）切割。 二、 RNA提取的基本原理與方法 （一）總 RNA提取的原理與方法 RNA提取的原理 (1) 單鏈狀，但許多區(qū)域可自身進行堿基配對，形成回折。 (2) 堿基配對規(guī)則： AU， GC，不能配對區(qū)域形成突起。 (3) RNA分子比 DNA分子小得多，一般含幾十至幾千個核苷酸 核苷酸之間的連結(jié)方式： 339。,539。磷酸二酯鍵 ?提取 RNA 的關鍵 分離純化完整的 mRNAS是進行分子克隆和基因表達分析 的基礎，真核生物 RNA分子方要分布于細胞質(zhì)和核仁，其中 mRNA占總 RNA的 15%，分子量大小不一，多數(shù)與蛋白質(zhì)結(jié) 合成核蛋白體的形式存在。 能否成功地提取真核生物的 RNA,關鍵在于能否完全抑制或 除去 RNA酶活性，分離獲得全長 RNA。 ?RNA酶的特點 (1)RNA酶的穩(wěn)定性 由于 RNA酶鏈內(nèi)二硫鍵的存在，使許多 RNA酶可抵抗長時間煮沸和溫和變性劑，變性的 RNA酶可迅速重新折疊。所以 RNA酶很穩(wěn)定 。 (2)RNA酶分布的廣泛性 RNA酶是所有生物生存所必須的酶 .玻璃器皿、操作平臺、以及浮塵中 ,人類的身體表面都有。 (3)RNA酶的活性 和大多數(shù) DNA酶不同， RNA酶不需要二價陽離子激活 ，因此難以被緩沖溶液中加入的 EDTA或其他金屬離子螯合劑失活。 所以在提取 RNA時，防止 RNA酶的降解是最重要的環(huán)節(jié)。防止 RNA酶的最好辦法就是在第一步即避免污染。 外源性的 RNA酶通常有兩個來源：
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