dna和rna的提取與純化-文庫吧資料
2025-05-19 21:22本頁面
【正文】 液裝置： 如果自動移液器以前被用來分配含有RNA酶的溶液 ， 那么使用一次性沒有 RNA酶的移液器頭已經沒有意義 。 外源性的 RNA酶通常有兩個來源： （ 1） 被污染的緩沖液： 由于粗心的無菌操作 ， 使緩沖液被細菌或其他的微生物污染 。 所以在提取 RNA時，防止 RNA酶的降解是最重要的環(huán)節(jié)。 (2)RNA酶分布的廣泛性 RNA酶是所有生物生存所必須的酶 .玻璃器皿、操作平臺、以及浮塵中 ,人類的身體表面都有。 ?RNA酶的特點 (1)RNA酶的穩(wěn)定性 由于 RNA酶鏈內二硫鍵的存在，使許多 RNA酶可抵抗長時間煮沸和溫和變性劑，變性的 RNA酶可迅速重新折疊。磷酸二酯鍵 ?提取 RNA 的關鍵 分離純化完整的 mRNAS是進行分子克隆和基因表達分析 的基礎，真核生物 RNA分子方要分布于細胞質和核仁，其中 mRNA占總 RNA的 15%，分子量大小不一，多數(shù)與蛋白質結 合成核蛋白體的形式存在。 (3) RNA分子比 DNA分子小得多，一般含幾十至幾千個核苷酸 核苷酸之間的連結方式： 339。 二、 RNA提取的基本原理與方法 （一）總 RNA提取的原理與方法 RNA提取的原理 (1) 單鏈狀，但許多區(qū)域可自身進行堿基配對，形成回折。 理論產量 =質?？截悢?shù) *分子量大小 *每亳升培養(yǎng)液中的大腸桿菌細胞總數(shù) ?RNA性質與結構 核糖核酸?；蚪M DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是 50－ 100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被 PDS共沉淀了 . 溶液 III， 3M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。基因組 DNA的斷裂會帶來麻煩 . 這其實是十二烷基硫酸鈉（ sodium dodecyl sulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（ potassium dodecylsulfate,PDS），而 PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀 . SDS專門和蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個 SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質沉淀了，同時大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。從而分離。而隨機斷裂產生的線性的染色體ＤＮＡ分子，彼此已經分離開來的互補鏈之間的復性作用就不會迅速。 變性處理過的質粒和染色體ＤＮＡ混合物，通過致冷或恢復中性 pH，便會迅速地復性。 通過加熱，尤其在 pH值介于 ，線性的 ＤＮＡ會被變性，而 cccDNA則不會變性。密度梯度離心后，處于不同的位置，從而達到純化質粒ＤＮＡ之目的。而質粒的共價閉合環(huán)狀的 ＤＮＡ分子，由于沒有游離末端，只能發(fā)生有限的解旋反應，結合ＥＢ分子的數(shù)量少。 利用在濃縮的鹽溶液中，溴化乙錠（ EB)扁平分子在ＤＮＡ堿基對之間的嵌入作用。 如多數(shù)雙鏈線狀 DNA分子的浮力密度約為 ,形成梯度 的 CsCl溶液的起始密度應為 1氯化銫密度梯度離心法 細胞裂解及ＤＮＡ分離過程中，大分子量的細菌染色體ＤＮＡ容易發(fā)生斷裂形成相應的線性片段，而質粒 ＤＮＡ則由于其分子量較少，結構緊密，所以仍保持完整狀態(tài)。由于銫原子很 重， CsCl的濃縮液在高速離心數(shù)小時后即可形成密度梯度。因此必須進行純化。 ?純化質粒 DNA 染色體ＤＮＡ分子以高分子量的形式釋放，可用高速度心方法除去得到清裂解液。根據(jù)質粒大小、菌株和裂解后用于 純化質粒 DNA的技術，采用不同的方法?？諝飧稍?。 細胞破碎后，加入 CTAB分離緩沖液，將 DNA 溶解出來 再經氯仿異戊醇抽提，除去蛋白，得到 DNA 苯酚作為蛋白變性劑，同時可抑制 DNA 酶的降解作用。 回收水相，用 2倍體積 95% 乙醇可將 DNA 鈉鹽沉淀出來。 (二 )DNA提取的幾種方法 根據(jù)細胞破碎后，分離 DNA 與蛋白質所采用的技術策略 不同，可分為以下幾種： 1濃鹽法 原理： RNP和 DNA在電解溶液中溶解度不同，從而分離。 5 DNA的溶解和貯存 回收的 DNA沉淀在溶解以前須在實驗臺上敞口放置一段時間 ， 使殘余的乙醇揮發(fā)掉 （ 或真空抽干 ） ， 然后加入適當體積的 TE緩沖液 ， 使 DNA溶解 。 在 PH為 8左右的 DNA溶液中 ， DNA分子是帶負電荷的 ， 加一定濃度的 NaAc或 NaCL,使 Na離子中和 DNA分子上的負電荷 , 減少 DNA分子之間的同性電荷相斥力 , 易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀 。一般實驗中，是加 2倍體積的無水乙醇與 DNA相混合，其乙醇的最終含量占 67％左右。 具體方法是將上面所提的上清液加入 2倍體積的無水乙醇和 mol/L的 NaCl， 顛倒混勻 ， 冰凍 30min. 可以觀察到絮狀的沉淀 ,即為 DNA， 經離心 ， 除去上清液 。 用 Tris 調節(jié)其 PH值到 平衡 ， 其原因是 DNA分子在此條件下 ， 比較穩(wěn)定 。一般采用氯仿與異戊醇之比為 24： 1，也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為 25： 24： 1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份 24： 1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。 在抽提 DNA時，為了混合均勻，必須振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。 經酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚 ， 由于酚與氯仿是互溶的 ， 可用氯仿第二次變性蛋白質 ， 此時一起將酚帶走 。 作為表面變性的酚和氯仿 ， 在去除蛋白質的作用中 ， 各有利弊 . 酚的變性作用大 ， 但酚與水相有一定程度的互溶 ， 大約 10％ － 15％ 的水
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