質(zhì)粒dna的提取和鑒定-文庫吧資料
2025-05-06 06:49本頁面
【正文】 nm有光吸收。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的 DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的 DNA分子：一般來說，其中閉環(huán)結(jié)構(gòu)泳動最快，其次為線性結(jié)構(gòu)，最慢的可能是單鏈開環(huán)。 ? 75%酒精主要是為了清洗鹽份和抑制 Dnase。 ? 溶液 III中的醋酸鉀是為了使鉀離子置換 SDS中的納離子而形成了 PDS，因?yàn)槭榛蛩徕c（ sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀 （ potassium dodecylsulfate, PDS），而 PDS是不溶水的，同時一個 SDS分子平均結(jié)合兩個氨基酸，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了。 SDS與 NaOH聯(lián)用，其目的是為了增強(qiáng) NaOH的強(qiáng)堿性，同時 SDS能很好地結(jié)合蛋白，產(chǎn)生沉淀。 質(zhì)粒 DNA的提取方法 堿裂解法基本原理 ? 葡萄糖是使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部， EDTA是 Ca2+和 Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，其主要目的是為了螯合二價金屬離子從而達(dá)到抑制 DNase的活性，避免質(zhì)粒被酶降解。堿裂 解法有操作簡便、快速、得率高的優(yōu)點(diǎn)。 常用的克隆載體有： pGEMT, pBR322, pUC18/19 ? 表達(dá)載體一般是將需要目的 DNA片段與載體相連接，導(dǎo)入原核細(xì)菌或真核細(xì)胞內(nèi)，使目的 DNA片段在菌內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)得到轉(zhuǎn)錄與翻譯，得到目的蛋白。 以應(yīng)用于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的 pPIC9載體為例解釋載體的構(gòu)件 ? 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要是否將片段進(jìn)行表達(dá)，將載體分為表達(dá)載體和克隆載體。 ? 轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒 DNA仍能進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生多個拷貝。 ? 質(zhì)粒的特點(diǎn)使其成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值。 ? 質(zhì)粒含有啟動子序列，能夠自我復(fù)制。質(zhì)?？稍诩?xì)胞間傳遞，其在胞內(nèi)的存在一般對宿主細(xì)胞的代謝活動無影響。 ? 質(zhì)粒（ plasmid）大小在 1kb～ 200kb之間，結(jié)構(gòu)簡單，大多是具有雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的 DNA分子，通常以超螺旋狀態(tài)存在于許多細(xì)菌和酵母菌中。綜合性設(shè)計性實(shí)驗(yàn) 6 ? 質(zhì)粒載體的選擇以及所插入的外源 DNA片段序列的生物信息學(xué)分析 ? 質(zhì)粒 DNA的提取與鑒定 ? 真核表達(dá)載體和 RNA干擾載體的使用 此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個部分 1. 第一部分，質(zhì)粒載體的選擇以及所插入的外源DNA片段序列生物信息學(xué)分析部分 2. 第二部分，質(zhì)粒 DNA的提取與鑒定實(shí)驗(yàn)操作部分 3. 第三部分，真核表達(dá)載體和 RNA干擾載體的使用 第一部分，質(zhì)粒載體的選擇
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