質(zhì)粒dna制備-文庫吧資料
2024-08-14 14:25本頁面
【正文】 粒。 ? 但是由于此法費用昂貴及流程長，近年來，發(fā)展了幾種不同的方法取代了超離法。 3．質(zhì)粒 DNA純化 ? 質(zhì)粒從細菌中分離出來以后，為滿足有些實驗的要求還應(yīng)進一步純化。 ? 細胞的裂解方法很多 ， 如去污劑法 ， 沸水熱裂法 、 堿變性法 ， 有機溶劑法和溶菌酶法等 。 ? 這種低效率擴增 ， 可利用高營養(yǎng)培養(yǎng)基促進生長 ， 一般可增加質(zhì)粒產(chǎn)量 46倍 。 而且細菌量的減少 ， 使得裂解物的復(fù)雜性和粘稠度降低 ， 操作更方便 、 有效 ， 對煮沸法更是如此 。 ? 對于新一代的質(zhì)粒如 pUC系列等，由于宿主對這些松弛型質(zhì)粒的復(fù)制控制不嚴，利用氯霉素對質(zhì)粒 DNA的選擇性擴增并不十分必要。 ? 對于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上受到宿主細胞的控制，故在細菌對數(shù)生長后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染色體 DNA的復(fù)制。 3．表達載體 ? 載體含有 tac啟動子 、 Lac操縱基因 、SD序列 、 Lac I阻遏蛋白基因等 。核苷酸的序次號，以 EcoRI序列 GAATTC的第一個 T為第一個核苷酸。 ? 若這種單一的限制性內(nèi)切酶位點處于選擇標記基因的內(nèi)部，外源基因片斷插入后會導(dǎo)致該基因失活便于篩選。 ? 若 lacZ基因被外源 DNA片斷插入而破壞，則不能制造半乳糖苷酶，菌落為白斑。 ? 大腸桿菌的 lac Z基因也常被用作為選擇的標記 ，此基因編碼半乳糖苷酶 ， 能分解一種有色基因(x)與半乳糖以糖苷鍵連結(jié)成的化合物 xgal。 ? 另一常用的抗藥性基因為四環(huán)素抗性(tetracycline resistance， tetr)基因，該基因編碼一種含 399氨基酸殘基的膜相關(guān)蛋白質(zhì)，能阻止四環(huán)素進入細胞。 5. 選擇的標記 ? 質(zhì)粒應(yīng)帶有一個或幾個可供選擇的標記，便于對轉(zhuǎn)化株的篩選?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 30多個這樣的不相容組。 ? 通過檢查不同質(zhì)粒在同一細胞中共存的能力，可以把它們分為若干不相容組。 ? 在一些細胞中 ， 一種質(zhì)粒處于優(yōu)勢 ， 而在另一些細胞中 ， 與之不相容的另一種質(zhì)粒卻占盡上風 。 ? 由于質(zhì)粒分子是從細胞內(nèi)的質(zhì)粒庫中隨機選取出來進行復(fù)制的 ， 所以兩個不同的質(zhì)粒在一個單細胞中的拷貝數(shù)并不總能保持相同 。這類質(zhì)粒在宿主細胞蛋白質(zhì)停止合成 (加入氯霉素 )、染色體 DNA停止復(fù)制的條件下，拷貝數(shù)繼續(xù)增加至數(shù)千。 ? 根據(jù)所含復(fù)制起始區(qū)的不同，有些質(zhì)粒的復(fù)制與宿主細胞染色體的復(fù)制同步，每個細胞只含有一個或幾個拷貝的質(zhì)粒，即處于 “ 嚴密控制 ” 。
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