質(zhì)粒dna提取純化與驗(yàn)證-文庫吧資料
2025-06-25 05:09本頁面
【正文】 加入溶液Ⅰ時(shí)，劇烈震蕩后，菌體沉淀轉(zhuǎn)變成均勻渾濁的菌懸液，此時(shí)細(xì)胞尚未破裂，染色體不會(huì)斷裂； 加入溶液Ⅱ時(shí)，菌液變粘稠、透明，無菌塊殘留，打開EP管時(shí)，可以看到粘稠的絲狀物。溴化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑，有毒性，使用含有這種染料的溶液時(shí)，應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。為了最大限度避免受到輻射，要確保紫外光源得到適當(dāng)遮蔽，并應(yīng)戴好目鏡(眼罩)或能夠有效阻擋紫外線的全副完全罩，避免皮膚直接暴露在紫外線下。也不要快速擠出吸頭內(nèi)的樣品，避免擠出的空氣將樣品沖出樣品孔。如下一步實(shí)驗(yàn)要求較高，則應(yīng)盡量使用TAE電泳緩沖液，并且，配制瓊脂糖凝膠的電泳緩沖液應(yīng)與電泳時(shí)使用的緩沖液為同一批配制的。同時(shí)，制膠時(shí)要將凝膠槽中的水擦拭干凈，避免對膠的均一性產(chǎn)生影響。對于低拷貝治理，在收集細(xì)胞之前，用氯霉素適當(dāng)處理，可以提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)。沉淀離心后，需用70％乙醇洗滌，以除去鹽類及揮發(fā)性較小的異丙醇。沉淀DNA通常使用預(yù)冷無水乙醇，在低溫條件下長時(shí)間放置可使DNA沉淀完全。酚具有腐蝕性，能損傷皮膚和衣物，使用時(shí)應(yīng)小心。加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后，應(yīng)緩慢上下顛倒離心管數(shù)次，切忌在漩渦振蕩器上劇烈震蕩，否則，染色體DNA會(huì)斷裂成小片段，不會(huì)形成沉淀，而溶解在溶液中，與質(zhì)粒DNA混合在一起，不利于質(zhì)粒DNA提純。在整個(gè)提取過程中出去染色體DNA的關(guān)鍵步驟是加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的變性和復(fù)性環(huán)節(jié)，應(yīng)控制好變形和復(fù)興的時(shí)機(jī)。離心結(jié)束后，將離心管從離心機(jī)取出時(shí)應(yīng)保持其傾斜狀態(tài)，防止沉淀重新進(jìn)入上清液中。將挑有菌體的接種環(huán)在三角瓶壁上輕輕接觸，然后輕輕搖動(dòng)三角瓶，讓液體的LB培養(yǎng)基輕輕沖刷菌體，當(dāng)觀察到附近的LB培養(yǎng)基有輕微渾濁現(xiàn)象時(shí)，接菌成功，再輕輕震蕩三角瓶，使全部菌體進(jìn)入培養(yǎng)基中。電泳完畢后，進(jìn)行EB染色，用凝膠成像儀拍照，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 2），混合，進(jìn)行點(diǎn)樣。將2管整合到一管，得到50ul質(zhì)粒DNA組，放置20℃下保存。向沉淀中加入5mL70%乙醇進(jìn)行洗滌，12000rpm離心2min,棄去上清液，重復(fù)洗滌一次； 37℃下保存5min,至離心管內(nèi)干燥，加入1mlTE緩沖液溶解，得粗提物，將粗提物轉(zhuǎn)移至新EP管，加入100ugRNase A（10ug/ul),將EP管放置于37℃下，保溫12小時(shí)。取離心管稱重（記為m2)，可測得菌體重量W=m2m1?！緦?shí)驗(yàn)步驟】擴(kuò)增質(zhì)粒（菌體培養(yǎng)） 1） DH5α菌，37℃恒溫倒置培養(yǎng)1618hr；之后，挑取單菌落，接種于20ml LB液體培養(yǎng)基（含Ampr80ug/ml）中，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜1214hr；再轉(zhuǎn)接一次，進(jìn)行50或100倍稀釋，同樣37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)46hr。(使用前用10M的NaOH和10%的SDS母液配置，防止NaOH吸收空氣中的H2O和CO2而減弱了堿性）。在121℃高壓滅菌15min ，貯存于4℃)。溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM TrisHCl(pH )，10mM EDTA(pH ）?！緦?shí)驗(yàn)儀器、材料及試劑】 儀器和材料接種環(huán)，培養(yǎng)皿，酒精燈，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)，漩渦振蕩器，微量移液器及多型號槍頭，微波爐，電泳儀等菌體： DH5α受體菌，具有Ampr標(biāo)記的質(zhì)粒pUC19。TAE緩沖液可以分離數(shù)KB長度的DNA，在精致DNA片段以及染色體DNA進(jìn)行雜交時(shí)經(jīng)常使用。電泳時(shí)常用的緩沖液有乙酸鹽（TAE）、硼酸鹽（TBE)和磷酸鹽（TPE）幾種不同的緩沖液，通常配制成10或5的濃度母液保存于室溫下，用時(shí)稀釋至工作濃度。5)緩沖液：緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移率。4)電泳所用電場：低電壓條件下，線性DNA片段的遷移速率與所用電壓成正比，電壓越高，帶電顆粒泳動(dòng)越快，但隨著電場強(qiáng)度的增加，不同長度DNA泳動(dòng)的增加程度不同，因此凝膠電泳分離DNA的有效范圍隨著電壓上升而減少。3)瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度不同。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。2)DNA分子的構(gòu)象：相對分子質(zhì)量相同而構(gòu)象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA的相對分子質(zhì)量
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