質(zhì)粒dna的提取、酶切及檢測(cè)-文庫(kù)吧資料
2025-06-01 18:28本頁(yè)面
【正文】 drome） 。 II 型限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱(chēng)順序 ，即有一個(gè)中心對(duì)稱(chēng)軸 ， 從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“ 讀 ” 都完全相同 。 因此 ， 這種限制性?xún)?nèi)切酶是 DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一 。 II型限制性?xún)?nèi)切酶 能識(shí)別專(zhuān)一的核苷酸順序 ，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈 。 ? 用一個(gè)字母代表菌株或型 ， 如流感嗜血菌Rd菌株用 d， 即 Hind。G， A等核苷酸表示酶的識(shí)別序列，箭頭表示酶切口。 ? EcoRⅠ 和 HindⅢ 的識(shí)別序列和切口是：EcoRⅠ :G↓ AATTC。 ? 乙醇：除去 DNA水化層，使 DNA沉淀 ? TE緩沖液：溶解 DNA 四、實(shí)驗(yàn)步驟 接含 PUC18(或 pET21a)質(zhì)粒的單菌落于 3ml LB Amp+液體培養(yǎng)基中 ? 370C， 190rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜 ? 取 dorf管中 12022rpm、 離心 2s， 棄上清，收集菌體 ? 100uL溶液 I懸浮菌體（ 充分振蕩 ），室溫（或冰?。?3min ? 加入 200uL溶液 II（ 輕輕混勻 ），冰上靜置 3min裂解菌體 ? 加入 150uL溶液 III（ 輕輕混勻 ），冰上靜置 5min質(zhì)粒 DNA復(fù)性 ? 12022rpm， 離心 5min， 取上清記錄體積到一新管 ? 上清加等體積的酚：氯仿：異戊醇（ 振蕩混勻 ） ? 12022rpm， 離心 15min， 取上清記錄體積到一新管 ? （可省略）上清加等體積的氯仿：異戊醇（ 振蕩混勻 ） ? 12022rpm， 離心 2min， 取上清記錄體積到一新管 ? 上清加 2倍體積的無(wú)水乙醇（ 充分混勻 ），室溫 2min ? 12022rpm， 離心 5min ? 沉淀用 70%乙醇 1mL洗滌兩次（ 振蕩混勻、離心 ） ? 12022rpm， 離心 2min ? 沉淀風(fēng)干 ? 沉淀用 20uL TE溶解， 200C保存 第二部分 質(zhì)粒酶切 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 理解限制性?xún)?nèi)切酶是 DNA重組技術(shù)的關(guān)鍵工具 ? 掌握酶切的基本操作 實(shí)驗(yàn)原理 ? 制性?xún)?nèi)切酶將質(zhì)粒和外源基因用限制性?xún)?nèi)切酶酶切，再經(jīng)過(guò) DNA連接酶連接，便可獲得攜
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