實(shí)驗(yàn)三、質(zhì)粒dna的酶切-文庫吧資料
2024-08-28 21:25本頁面
【正文】 一定要根據(jù)被分離 DNA片段的大小確定好合適的瓊脂糖凝膠濃度。市場(chǎng)銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液（ 1 ）進(jìn)行稀釋。一般 1U 限制性內(nèi)切酶于 37℃ 條件下作用底物 DNA 1h以上可切割 1μg λDNA 。 3．限制性內(nèi)切酶一定要低溫下貯存 (－ 20℃) ，以防止酶活性降低。 2．進(jìn)行 DNA酶切時(shí)，要在其最適溫度下 (大多數(shù)為 37℃) 進(jìn)行，最好使用每一種酶的專用緩沖液。 觀察結(jié)果：取出內(nèi)槽，將凝膠小心推入紫外掃描分析儀的玻璃平板上，關(guān)上儀器防護(hù)屏，在計(jì)算機(jī)上觀察并掃描記錄質(zhì)粒 DNA與酶切 DNA電泳結(jié)果，比較分析經(jīng)酶切與未經(jīng)酶切的 DNA圖譜的區(qū)別。 電泳： 接通電源槽與電泳儀的電源 (點(diǎn)樣端接負(fù)極，另一端接正極 )，調(diào)好電壓 (5 V/cm凝膠長(zhǎng)度 )，開始電泳。 加樣：剪取適當(dāng)大小的蠟?zāi)?(Parafilm膜 )，取 6 上樣緩沖液 1 μl 點(diǎn)于膜上數(shù)點(diǎn)。待膠凝固后，小心取出梳子，將帶凝膠的內(nèi)槽放入電泳槽中，凝膠點(diǎn)樣端靠近負(fù)極。 （二） 酶切產(chǎn)物的電泳分離和鑒定 稀釋緩沖液的制備：取 5 TBE緩沖液 5 ml加水至 50 ml，配制成 TBE稀釋緩沖液。 操作步驟 ： （一） 酶切反應(yīng) 1． 酶切混合液配制：將緩沖液 5 μl 、重組質(zhì)粒DNA (5μg,30 ul) 、限制性內(nèi)切酶 510U（ 1ul）加至 Eppendorf管中，加雙蒸水至 50 μl ，加蓋，混勻后稍離心； 2. 37℃ 水浴箱中反應(yīng) 12h； 3. 終止酶反應(yīng)：可根據(jù)需要采用不同的方法。 3．溴化乙錠 (EB， 1 mg/ml)戴手套謹(jǐn)慎稱取 EB 20 mg于棕色試劑瓶中，加 20ml雙蒸水，溶解后貯于 4℃ 備用，配制瓊脂糖凝膠時(shí)每 100 ml凝膠加 50 μl EB 。 TAE為配制瓊脂糖凝膠及其電泳的應(yīng)用緩沖液。 2．限制性內(nèi)切酶及其緩沖液購自 TAKARA公司，在配套的緩沖液中該限制性內(nèi)切酶均可獲得100%酶切活性。 一、 設(shè)備 75℃ 的恒溫水浴箱 、核酸電泳儀和電泳槽、紫外掃描分析儀、紫外凝膠成像儀、臺(tái)式高速離心機(jī)、微波爐、移液器、 ependdorf管及離心管架等。星號(hào)活力的識(shí)別形式常對(duì)標(biāo)準(zhǔn)識(shí)別序列中兩側(cè)的堿基沒有特異性，如 EcoRⅠ 在高 pH或低鹽離子強(qiáng)度下，其識(shí)別序列由 G AATTC變?yōu)?N AATTN，另一種情況是對(duì) AATT中的 A、 T分辨不嚴(yán)格。 限制性內(nèi)切酶的星號(hào)活力 ： 限制性內(nèi)切酶在非標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件下，能切割一些與其識(shí)別序列類似的序列，這種現(xiàn)象稱星號(hào)活力 。 對(duì)質(zhì)粒 DNA酶切反應(yīng)而言 , 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系 1 μg DNA 加 1單位酶，消化 12小時(shí)。 在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般 DNA用量約為 。 N=A,C,G,T Promega公司酶切緩沖液的選取表 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止 通常有以下三種方法： 采用 65℃ 條件下溫浴 20min，通過加熱失活內(nèi)切酶； 加終止反應(yīng)液（如 mol/L的 EDTA使之在溶液中的終濃度達(dá)到 10 mmol/L）螯合內(nèi)切酶的輔助因子 Mg2+使內(nèi)切酶變性以終止反應(yīng)； 通過電泳割膠回收或用酚 /氯仿抽提，然后乙醇沉淀，此法最為有效且有利于下一步的 DNA的操作。 V=G,C,A。 H=A,C T。 S=G, C。 M=A, C。 緩沖液 NaCl TrisHCl() MgCl2 DTT 低離子強(qiáng)度 0～ 10 mmol／ L 10 mmol／ L 10 mmol／ L 1 mmol／ L 中離子強(qiáng)度 50 mmol／ L 10 mmol／ L 10 mmol／ L 1 mmol／ L 高離子強(qiáng)度 100 mmol／ L 50 mmol／ L 10 mmol／ L 1 mmol／ L 各種緩沖液配方 各種酶對(duì)不同緩沖液
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