實(shí)驗(yàn)三、質(zhì)粒dna的酶切(編輯修改稿)
2024-09-11 21:25 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 加 1單位酶，消化 12小時(shí)。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加 25倍，反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長， 但過分加大酶量，甘油會影響反應(yīng)外，酶本身會導(dǎo)致識別序列的特異性下降 ,產(chǎn)生酶的星號活力 。 限制性內(nèi)切酶的星號活力 ： 限制性內(nèi)切酶在非標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件下，能切割一些與其識別序列類似的序列，這種現(xiàn)象稱星號活力 。每一種酶在特別的條件下均會產(chǎn)生這種活力。星號活力的識別形式常對標(biāo)準(zhǔn)識別序列中兩側(cè)的堿基沒有特異性，如 EcoRⅠ 在高 pH或低鹽離子強(qiáng)度下，其識別序列由 G AATTC變?yōu)?N AATTN，另一種情況是對 AATT中的 A、 T分辨不嚴(yán)格。 產(chǎn)生星號活力的原因：高甘油含量、酶量過大、低離子強(qiáng)度、高 pH（ ）、含有有機(jī)溶劑、非 Mg2+的二價(jià)離子存在。 一、 設(shè)備 75℃ 的恒溫水浴箱 、核酸電泳儀和電泳槽、紫外掃描分析儀、紫外凝膠成像儀、臺式高速離心機(jī)、微波爐、移液器、 ependdorf管及離心管架等。 二、 材料 1． DNA底物 λDNA 或 重組質(zhì)粒 DNA或制備的植物組織 DNA。 2．限制性內(nèi)切酶及其緩沖液購自 TAKARA公司，在配套的緩沖液中該限制性內(nèi)切酶均可獲得100%酶切活性。 Tip頭 三、 試劑 1． 5 TBE電泳緩沖液：稱取 Tris 54 g，硼酸 g，并加入 EDTA () 20ml，定溶至 1000 ml。 TAE為配制瓊脂糖凝膠及其電泳的應(yīng)用緩沖液。 2．溴酚藍(lán)指示劑溶液 (6 上樣緩沖液 )稱取溴酚藍(lán) 100 mg，加雙蒸水 5 ml，在室溫下過夜，待溶解后再稱取蔗糖 25 g，加雙蒸水溶解后移入溴酚藍(lán)溶液中，搖勻后定容至 50 ml，加入 NaOH 1滴，調(diào)至藍(lán)色。 3．溴化乙錠 (EB， 1 mg/ml)戴手套謹(jǐn)慎稱取 EB 20 mg于棕色試劑瓶中，加 20ml雙蒸水，溶解后貯于 4℃ 備用，配制瓊脂糖凝膠時(shí)每 100 ml凝膠加 50 μl EB 。 4． DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)需要購買，一般濃度為 μg/μl 。 操作步驟 ： （一） 酶切反應(yīng) 1． 酶切混合液配制：將緩沖液 5 μl 、重組質(zhì)粒DNA (5μg,30 ul) 、限制性內(nèi)切酶 510U（ 1ul）加至 Eppendorf管中，加雙蒸水至 50 μl ，加蓋，混勻后稍離心； 2. 37℃ 水浴箱中反應(yīng) 12h； 3. 終止酶反應(yīng)：可根據(jù)需要采用不同的方法。①酶切后不需進(jìn)行下一步反應(yīng)，可加入含 EDTA的終止液終止反應(yīng)；②若需進(jìn)一步反應(yīng) (如連接，切割等 )，可將反應(yīng)管置 65℃ 保溫 2030分鐘，以滅活酶終止反應(yīng)；③可用酚 /氯仿抽提，乙醇沉淀獲得較純 DNA或 割膠回收 DNA進(jìn)行下一步酶學(xué)操作 。 （二） 酶切產(chǎn)物的電泳分離和鑒定 稀釋緩沖液的制備：取 5 TBE緩沖液 5 ml加水至 50 ml，配制成 TBE稀釋緩沖液。 膠板的制備：將冷卻至 60℃ 左右的瓊脂糖凝膠液，緩慢倒入內(nèi)槽，直至所需厚度，注意不要形成氣泡，特別是梳子下，如有氣泡可用牙簽挑破。待膠凝固后，小心取出梳子，將帶凝膠的內(nèi)槽放入電泳槽中，凝膠點(diǎn)樣端靠近負(fù)極。 加入 1 TAE緩沖液至電泳槽中，使緩沖液淹過凝膠表面 CM。 加樣：剪取適當(dāng)大小的蠟?zāi)?(Parafilm膜 )，取 6 上樣緩沖液 1 μl 點(diǎn)于膜上數(shù)點(diǎn)。取 5 μl 酶切 DNA樣品、 μg 未酶切質(zhì)粒 DNA、 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)分別與上樣緩沖液混勻，將其分別加入凝膠點(diǎn)樣孔，記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量。 電泳： 接通電源槽與電泳儀的電源 (點(diǎn)樣端接負(fù)極，另一端接正極 )，調(diào)好電壓 (5 V/cm凝膠長度 )，開始電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動至凝膠前沿約 1 cm處，切斷電源，停止電泳。 觀察結(jié)果：取出內(nèi)槽，將凝膠小心推入紫外掃描分析儀的玻璃平板上，關(guān)上儀器防護(hù)屏，在計(jì)算機(jī)上觀察并掃描記錄質(zhì)粒 DNA與酶切 DNA電泳結(jié)果，比較分析經(jīng)酶切與未經(jīng)酶切的 DNA圖譜的區(qū)別。 注意事項(xiàng) ： 1．酶切時(shí)所加的 DNA溶液體積不能太大，否則 DNA溶液中其他成分會干擾酶反應(yīng)。 2．進(jìn)行 DNA酶切時(shí)，要在其最適溫度下
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