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正文內(nèi)容

實(shí)驗(yàn)二-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、酶切鑒定(編輯修改稿)

2024-08-31 15:22 本頁(yè)面
 

【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 提高特異性的添加劑。PCR污染及預(yù)防措施潛在的污染源包括待檢者、操作人員身體表面,實(shí)驗(yàn)室的一切試劑、器材及儀器或其它與擴(kuò)增產(chǎn)物接觸的任何東西都可能成為潛在的污染源。1)預(yù)防措施:①分開操作區(qū)域。在專用超凈工作臺(tái)進(jìn)行樣品制備,專設(shè)工作臺(tái)進(jìn)行PCR操作,PCR 產(chǎn)物在另一工作臺(tái)進(jìn)行結(jié)果分析;所有工作區(qū)域應(yīng)經(jīng)常使用紫外線消毒。②耐高壓的試劑及器材應(yīng)高壓滅菌,但酶、引物、dNTP、加樣器等不能高壓滅菌,以免試劑失活或器材損壞。③使用一次性Tip頭、Eppendorf管等。 ④小量分裝所有試劑。⑤樣品制備應(yīng)按無(wú)菌操作原則進(jìn)行,避免樣品間相互污染。⑥操作者帶手套操作,且應(yīng)勤換手套。⑦用于PCR的加樣器絕不能用于PCR 產(chǎn)物分析。⑧使用尿嘧啶DNA糖基化酶控制PCR產(chǎn)物交叉污染。這是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的避免污染的較好的方法。其原理是:在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中以 dUTP取代dTTP,使擴(kuò)增產(chǎn)物中含有尿嘧啶。在以后的PCR擴(kuò)增前用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)處理,UDG切割污染DNA上的尿嘧啶,DNA斷裂,TaqDNA聚合酶不可能再擴(kuò)增污染的DNA 片段,而UDG對(duì)天然的核酸模板無(wú)影響。然后加熱去除UDG活性,再做PCR, 即可防止PCR產(chǎn)物污染。⑨每次PCR操作都應(yīng)設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照使用能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體DNA,陰性對(duì)照不加模板或加其它來(lái)源的DNA,試劑加樣操作取量同待測(cè)標(biāo)本。2)污染源的處理①稀酸或84′消毒液處理法:用1 mol/L HCl或適量84′消毒液處理污染源,使殘存的DNA脫嘌呤降解。②紫外線照射法:選用波長(zhǎng)254~300nm的紫外線照射30min即可。紫外線對(duì)500bp以上DNA片段有效,對(duì)短片段效果不大。③反應(yīng)液污染的處理:在PCR反應(yīng)液(不含Taq DNA聚合酶和模板) U DNase I或核酸內(nèi)切酶(如10U的MspI),室溫下30~60min。加熱滅活DNase I或核酸內(nèi)切酶,再加入Taq DNA聚合酶和模板做PCR。第二節(jié) 酶切技術(shù)目的:掌握限制酶消化PCR產(chǎn)物的一般方法。原理:線粒體12S rRNA基因如無(wú)A1555G突變,則有BsmAI識(shí)別位點(diǎn),PCR產(chǎn)物被酶切,瓊
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