廣西地方標(biāo)準(zhǔn)豬藍(lán)耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鑒別檢測(cè)多重?zé)晒舛糠崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法征求意見稿(編輯修改稿)
2024-09-16 18:44 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 方法使用下列儀器設(shè)備：a）熒光定量 PCR 儀；b）核酸蛋白分析儀；DB45/T XXXXX—XXXX3c）高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；d）組織勻漿機(jī)；e）混勻器；f）微量移液器。 一次性耗材一次性耗材包括：a）乳膠手套；b）離心管；c）PCR 反應(yīng)管；d）吸頭；e）熒光 PCR 反應(yīng)管。注：離心管、PCR 反應(yīng)管、吸頭、熒光PCR反應(yīng)管等應(yīng)使用無 RNA 酶的一次性塑料制品。否則，應(yīng)在使用前經(jīng) DEPC水處理，然后用 10 5 Pa 高壓滅菌 30 min。4 操作方法 操作環(huán)境以下操作應(yīng)在生物安全I(xiàn)I級(jí)或II級(jí)以上防護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)、無RNA酶的環(huán)境下進(jìn)行?！〈龣z樣品處理采取病豬的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等組織共約 1 g，置于 mL 離心管中，加入滅菌的 1 mol/L PBS（pH ）1 mL，用組織勻漿機(jī)充分研磨后，反復(fù)凍融 3 次；細(xì)胞培養(yǎng)物則直接反復(fù)凍融 3 次。以 10 000 g離心 5 min，收集上清，用于總 RNA 抽提，或置 20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｑ鍢悠房芍苯佑糜诳? RNA 抽提，或置 20 ℃ 保存?zhèn)溆?。 待檢樣品總 RNA 提取取 200 181。L 待檢樣品于無 RNA 酶的 mL 離心管中，按照 RNA 提取試劑盒操作說明書抽提總 RNA ?！》崔D(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積為?10 ?181。L。在冰浴條件下，在 PCR 反應(yīng)管中按下列用量分別加入各成分：a）10?RT 緩沖液：1?181。L；b）AMV?反轉(zhuǎn)錄酶（5 U/181。L）：?181。L；c）dNTP?混合物（各?10?mM/L）：1?181。L ；d）RNA?酶抑制劑（40 U/181。L）：?181。L；e）MgCl 2溶液（25 mM/L）：2?181。L；f）隨機(jī)引物?9?聚體（50?pmol/181。L）：?181。L； g）待檢總 RNA 模板：4 181。L；h）滅菌雙蒸水：補(bǔ)足總體積至 10 181。L。DB45/T XXXXX—XXXX4加完試劑后瞬時(shí)離心混勻。將?PCR?反應(yīng)管置于普通 PCR 儀內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ?℃，10 min；42 ?℃，30 min；95 ?℃，5 min。獲得的 ?cDNA?直接用于?熒光定量 PCR 擴(kuò)增，或置20 ?℃?保存?zhèn)溆?。 多重?zé)晒舛?PCR反應(yīng)總體積為?25 ?181。L。在冰浴條件下，在熒光?PCR?反應(yīng)管中按下列用量分別加入各成分：a）Premix Ex Taq 聚合酶： 181。L；b）ROX 參比染料 II： 181。L；c）NAPRRSVF、NAPRRSVR 引物（25 pmol/181。L）：各 181。L；d）TJMPRRSVF,TJMPRRSVR 引物（25 pmol/181。L）：各 1181。L；e）NAVPRRSVP 探針（25 pmol/181。L）： 181。L；f）NACPRRSVP 探針（25 pmol/181。L）： 181。L；g）TJMPRRSVP 探針（25 pmol/181。L）：1 181。L；h）反轉(zhuǎn)錄獲得的 cDNA：2 181。L；i）滅菌雙蒸水：補(bǔ)足總體積至 25 181。L。加完試劑后瞬時(shí)離心混勻。將熒光 PCR 反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀內(nèi)，按如下程序進(jìn)行反應(yīng)：預(yù)變性 95 ℃20 s；95 ℃5 s；56 ℃20 s ，共 40 個(gè)循環(huán)；在每次循環(huán)的退火延伸時(shí)分別收集FAM、JOE和TAMRA通道的熒光信號(hào)。注：某些商業(yè)公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀需加入ROX參比染料?！￡栃詫?duì)照及陰性對(duì)照 陽性對(duì)照以CPRRSV VR2332毒株、HPPRRSV JXA1毒株、VPRRSV TJMF92毒株的cDNA為陽性對(duì)照。病毒細(xì)胞培養(yǎng)物的處理、?；蛘?，使用CPRRSV pCNsp2 質(zhì)粒、HPPRRSV pVNsp2 質(zhì)粒及VPRRSV pTJMNsp2質(zhì)粒作為陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。用核酸蛋白分析儀測(cè)定其光吸收值( OD260nm )后計(jì)算濃度，用滅菌雙蒸水稀釋至?106 拷貝/μL，作為陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，20 ℃ 保存?zhèn)溆?。注：重組質(zhì)粒pCNsppVNsppTJMNsp2的制備方法見附錄C。 陰性對(duì)照用 滅菌雙蒸水代替模板作為陰性對(duì)照模板。5 結(jié)果判定 結(jié)果分析條件設(shè)定閾值設(shè)定根據(jù)儀器背景噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過陰性對(duì)照樣品
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