廣西地方標準豬藍耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鑒別檢測多重熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法征求意見稿-資料下載頁
2024-08-29 18:44本頁面
【正文】 RRSV（+）；3 VPRRSV（+）；4 陰性對照。圖 PRRSV 多重熒光定量 RTPCR 擴增曲線圖DB45/T XXXXX—XXXX8附 錄 B（規(guī)范性附錄）試劑盒 商業(yè)化的RNA?抽提試劑盒主要成分包括：a）細胞裂解液；b）Proteinase K；c）Carrier RNAd）洗液；e）無水乙醇；f）DEPC 水；g）過濾柱?！∩虡I(yè)化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒主要成分包括：a）10?RT?緩沖液；b）AMV 反轉(zhuǎn)錄酶；c）dNTP?混合物：包括 dATP、dTTP、dCTP、dGTP；d）RNA?酶抑制劑；e）氯化鎂（MgCl 2）溶液；f）隨機引物?9?聚體?！∩虡I(yè)化的熒光定量PCR試劑盒主要成分包括：a） Taq DNA?聚合酶預(yù)混劑：包含 Ex Taq 聚合酶、dNTP 混合物、氯化鎂（MgCl 2）等；b）ROX 參比染料 II。 商業(yè)化的 RTPCR 試劑盒主要成分包括：a）10?RT 緩沖液；b）AMV 反轉(zhuǎn)錄酶；c）dNTP?混合物：包含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP；d）RNA?酶抑制劑；e）MgCl 2 溶液；f）隨機引物?9?聚體；g）5 RT buffer；DB45/T XXXXX—XXXX9h）Ex Taq HS 聚合酶?！∧z回收試劑盒主要成分包括：a）GM緩沖液；b）WB緩沖液；c）洗脫緩沖液；d）離心柱；e）收集管?！4 連接試劑盒主要成分包括：a）T4 DNA連接酶；b）10T4 DNA 連接酶緩沖液。 質(zhì)粒提取試劑盒主要成分包括：a）RNase A（10 mg/mL）；b）溶液Ⅰ；c）溶液Ⅱ；d）溶液Ⅲ；e）WA緩沖液；f）WB緩沖液；g）洗脫緩沖液；h）離心柱；i）收集管。DB45/T XXXXX—XXXX10B B附 錄 C（規(guī)范性附錄）重組質(zhì)粒標準品制備 特異性引物?！〔《竞怂崽崛〖癛TPCR擴增分別取CPRRSV VR2332株、HPPRRSV JXA1株、VPRRSV TJMF92株細胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，以10 000 g離心 3 min，收集上清，（RT） ，獲得cDNA。以獲得的cDNA為模板，分別利用NAPRRSVF/NAPRRSVR、TJMPRRSVF/TJMPRRSVR引物對，建立50 181。 L反應(yīng)體系，進行單重PCR擴增。在冰浴條件下，在 PCR 反應(yīng)管中按下列用量分別加入各成分：a）5 RT buffer:10 μL； b）Ex Taq HS 聚合酶（5 U/μL）： 181。L；c）上、下游引物（25 pmol/μL）：各 1 181。L；d）cDNA 模板：5 181。L；e）滅菌雙蒸水：補足總體積至 50 181。L。加完試劑后瞬時離心混勻。將 PCR 反應(yīng)管置于 PCR 儀內(nèi)，反應(yīng)程序為：94 ℃ 2 min；然后94 ℃30 s，56 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,循環(huán) 35 次；最后72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物直接用于電泳，或置 4 ℃ 保存?zhèn)溆??！≈亟M質(zhì)粒標準品構(gòu)建將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳、用凝膠成像系統(tǒng)觀察后，按膠回收試劑盒說明書回收、純化PCR產(chǎn)物。按T4連接酶試劑盒說明書將PCR產(chǎn)物連接到pMD18T載體，然后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，涂布于LB/Amp+/Xgal/IPTG平板上37℃培養(yǎng)。挑選陽性菌落，増菌培養(yǎng)后，按質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。注：商業(yè)化的RTPCR試劑盒、膠回收試劑盒、T4連接酶試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒主要成分分別見附錄?B 、 、使用前經(jīng)技術(shù)驗證合格?！≈亟M質(zhì)粒標準品鑒定 PCR鑒定以提取的質(zhì)粒為模板，、凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察?！∶盖需b定DB45/T XXXXX—XXXX11以提取的質(zhì)粒為模板，用 EcoR I和 Hind III內(nèi)切酶在37℃酶切2 h，進行凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察。 測序鑒定對獲得的質(zhì)粒送商業(yè)測序公司進行測序，并將獲得的序列在NCBI上進行比對，確認所獲得的序列與標準毒株相應(yīng)區(qū)域的序列一致。以上經(jīng)PCR、酶切、測序鑒定正確的重組質(zhì)粒，分別命名為pCNsppVNsp2和pTJMNsp2，可作為PCR反應(yīng)的陽性標準品。_________________________________
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