廣西地方標(biāo)準(zhǔn)豬藍(lán)耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鑒別檢測多重?zé)晒舛糠崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法征求意見稿(參考版)
2024-08-31 18:44本頁面
【正文】 _________________________________?！y序鑒定對獲得的質(zhì)粒送商業(yè)測序公司進(jìn)行測序，并將獲得的序列在NCBI上進(jìn)行比對，確認(rèn)所獲得的序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株相應(yīng)區(qū)域的序列一致?！≈亟M質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品鑒定 PCR鑒定以提取的質(zhì)粒為模板，、凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察。挑選陽性菌落，増菌培養(yǎng)后，按質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒?！≈亟M質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳、用凝膠成像系統(tǒng)觀察后，按膠回收試劑盒說明書回收、純化PCR產(chǎn)物。將 PCR 反應(yīng)管置于 PCR 儀內(nèi)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；然后94 ℃30 s，56 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,循環(huán) 35 次；最后72 ℃ 10 min。L。L；d）cDNA 模板：5 181。在冰浴條件下，在 PCR 反應(yīng)管中按下列用量分別加入各成分：a）5 RT buffer:10 μL； b）Ex Taq HS 聚合酶（5 U/μL）： 181。以獲得的cDNA為模板，分別利用NAPRRSVF/NAPRRSVR、TJMPRRSVF/TJMPRRSVR引物對，建立50 181。DB45/T XXXXX—XXXX10B B附 錄 C（規(guī)范性附錄）重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備 特異性引物?！4 連接試劑盒主要成分包括：a）T4 DNA連接酶；b）10T4 DNA 連接酶緩沖液。 商業(yè)化的 RTPCR 試劑盒主要成分包括：a）10?RT 緩沖液；b）AMV 反轉(zhuǎn)錄酶；c）dNTP?混合物：包含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP；d）RNA?酶抑制劑；e）MgCl 2 溶液；f）隨機(jī)引物?9?聚體；g）5 RT buffer；DB45/T XXXXX—XXXX9h）Ex Taq HS 聚合酶?！∩虡I(yè)化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒主要成分包括：a）10?RT?緩沖液；b）AMV 反轉(zhuǎn)錄酶；c）dNTP?混合物：包括 dATP、dTTP、dCTP、dGTP；d）RNA?酶抑制劑；e）氯化鎂（MgCl 2）溶液；f）隨機(jī)引物?9?聚體。1 HPPRRSV（+）；2 CPRRSV（+）；3 VPRRSV（+）；4 陰性對照。擴(kuò)增VPRRSV TJMF92株Nsp2基因目的片段的核苷酸序列如下：CAACCCTGCACCTGTGTCATCAAGCAGCTCCCTGTCAAGTGTTAAGATCACACGCCCAACACGCATCCTCGGGAAAATAGGAGACACTGACGAGCTGCTTGACCGGGGTCCCTCGGTACCCTCCAAGGGAGAA PRRSV 特異性探針序列探針序列相關(guān)信息見表?。擴(kuò)增CPRRSV代表毒株VR2332株（GenBank 登錄號：AY150564）Nsp2基因目的片段的核苷酸序列如下：GAGTGAGCCGGCTCCAATTCCCGCACCTCGCGGAACTGTGTCTCGACCGGTGACACCCTTGAGTGAGCCGATCCCTGTGCCCGCACCGCGGCGTAAGTTTCAGCAGGTGAAAAGATTGAGTTCGGCGGCGGCAATCCCACCGTACCAGGACGAGCCCCTGGATTTGTCTGCTTCCTCACAGACTGAATATGAGGC 擴(kuò)增的HPPRRSV Nsp2基因目的片段擴(kuò)增HPPRRSV Nsp2基因中108 bp 的片段。表 引物序列及擴(kuò)增長度引物名稱 引物序列（5′→3′） 針對毒株 長度（bp）NAPRRSVF GAGTGGGTCGGCTCCAGTTCNAPRRSVR GCCTCATATTCCGTCTGTGA CPRRSV/HPPRRSV195 或 108TJMPRRSVF CAACCCTGCACCTGTGTCATTJMPRRSVR TTCTCCCTTGGAGGGTGCC VPRRSV 133注：NAPRRSVF 和 NAPRRSVR 引物對擴(kuò)增 CPRRSV 時長度為 195 bp，擴(kuò)增 HPPRRSV 時長度為 108 bp；TJMPRRSVF和 TJMPRRSVR 引物對擴(kuò)增 VPRRSV 時長度為 133 bp。注：PRRSV?多重?zé)晒舛縍TPCR結(jié)果曲線圖見附錄 A?中的圖 。 若被檢樣品出現(xiàn) HPPRRSV 的特異性擴(kuò)增曲線，且 Ct 值 ≤ 36，判定為 HPPRRSV 陽性，記為HPPRRSV（
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