聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用(參考版)
2025-05-29 18:12本頁面
【正文】 。為數(shù)不 少的 PCR檢測(cè)程序已自動(dòng)化，包括樣品預(yù)處理、擴(kuò)增反應(yīng)、產(chǎn)物檢測(cè)。 PRINS是 FISH和 PCR的結(jié)合：首先使寡聚核苷酸引物與處于 M期的 染色體 DNA退火， 然后在熒光標(biāo)記的核苷酸和 Taq DNA聚合酶的存在下 進(jìn)行延伸反應(yīng)，合成一系列長度在 2001000 bp之間 的 熒光探針，進(jìn)而 繪制細(xì)胞染色體的彩色圖譜。 采用 不對(duì)稱性 PCR程序擴(kuò)增待分析的靶基因序列，獲得特異性 單鏈 DNA， 然后在 非變性條件下走聚丙烯酰凝膠電泳，與對(duì)照樣品進(jìn)行比較 即可檢測(cè)出可能存在的堿基突變類型。 5’ 5’ 5’ dGTP 5’ 5‘ CCCCCCCC PCR 3‘ GGGGGGGG 5’ 5‘ CCCCCCCC 3’ PCR 5‘ CCCCCCCC 5’ 特異性引物 7 PCR技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用 特定 DNA序列的克隆與重組子的鑒定 PCRSSCP檢測(cè)基因序列 DNA洗牌術(shù)（ Shuffling） 染色體 DNA的引物原位雜交 DNA的體外定點(diǎn)突變與分析 同源重組子的檢測(cè) 特定 DNA序列的克隆與重組子的鑒定 GAATTC CTTAAG GGATCC CCTAGG PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物克隆 EcoRI BamHI PCR鑒定 DNA的體外定點(diǎn)突變與分析 PCR擴(kuò)增 突變位點(diǎn) 變性復(fù)性 除去引物 延伸 加外側(cè)引物 同源重組子的檢測(cè) 同源整合 目的基因 同源交換 目的基因 整合位點(diǎn) PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增 PCRSSCP檢測(cè)基因序列 將 PCR技術(shù)與 單鏈構(gòu)型多態(tài)性 （ SSCP） 分析技術(shù)聯(lián)合使用，可以 有效地檢測(cè)和分析基因序列的突變性質(zhì)。適用于繪制真 核生物龐大基因或基因 組中的缺失圖譜，如分 子病的臨床輔助診斷。 內(nèi)標(biāo)使用相同的引物，與待測(cè)樣品具有相似的長度、堿基組成以 及對(duì)抑制劑的敏感性，但又必須與待測(cè)樣品有所區(qū)別，以便在擴(kuò)增產(chǎn) 物檢測(cè)分析時(shí)能夠辨認(rèn)（如引物的檢測(cè)方式不同）。 一個(gè)典型的原位 PCR程序包括下列四個(gè)步驟： 待檢測(cè)的組織或細(xì)胞用甲醛溶液固定 用蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透性處理，確保 PCR試劑能進(jìn)入細(xì)胞 對(duì) DNA或 RNA靶序列進(jìn)行胞內(nèi)原位擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通常用地高辛系統(tǒng)標(biāo)記， 色譜檢測(cè)儀檢測(cè) 定量 PCR（ Quantitative PCR） 理論上講， PCR產(chǎn)物以指數(shù)規(guī)律增殖，但在所有的擴(kuò)增循環(huán)（尤 其是后十輪）中，眾多引物 模板分子上的反應(yīng)由于抑制劑的作用并非 100%的有效，因此精確定量 PCR產(chǎn)物必須使用 內(nèi)標(biāo) （擴(kuò)增對(duì)照）。 不對(duì)稱 PCR中的兩條引物濃 度一般采用 50100∶ 1的配比， 在最初的 10 15個(gè)循環(huán)中，主要 產(chǎn)物還是雙鏈 DNA， 但當(dāng)?shù)蜐舛? 的引物耗盡后，高濃度引物引導(dǎo) 的 PCR反應(yīng)便會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈 原位 PCR（ In Situ PCR） 原位 PCR是 PCR技術(shù) 與原位雜交技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物。 標(biāo)準(zhǔn)的 RTPCR程序包括： mRNA的分離 cDNA反應(yīng)的引物退火 mRNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA cDNA的 PCR擴(kuò)增 引物選擇有三種戰(zhàn)略： 基因特異性引物化（ GSP）， 最精確最靈敏 寡聚 dT引物化 隨機(jī)六聚體引物化 反向 PCR（ Inverted PCR） 通常 ， PCR反應(yīng)是對(duì)兩條引物之間 的序列進(jìn)行擴(kuò)增，但如果將模板 DNA稍 酶切 環(huán)化 酶切 擴(kuò)增 做處理，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)已知序列兩側(cè)的片 段進(jìn)行擴(kuò)增，這種戰(zhàn)略稱為 反向 PCR技 術(shù) 。兩種酶的配比如下： 其中， Pfu和 DeepVent起著二次校對(duì)的作用。 對(duì)于 100ml以下的反應(yīng)體積還應(yīng)該用油封頂，以減少反應(yīng)體系的 蒸發(fā)濃縮效應(yīng)。 反應(yīng)體積 反應(yīng)體積 的標(biāo)準(zhǔn)范圍： 20 100 ml（ ml的小離心管 ） 有效性的改進(jìn)： 增加反應(yīng)體積以及保溫時(shí)間，以充分保證熱平衡； 5 ml的反應(yīng)體積也有成功的例子。達(dá)到這個(gè)階段所需要的循環(huán)次數(shù)可由下式計(jì)算： 影響上述擴(kuò)增閾值的主要因素包括： 擴(kuò)增底物（引物和 dNTPs） 有效濃度的下降 Nf = N0 X 2 N 其中 N為循環(huán)次數(shù)， N0為起始拷貝數(shù)， N0為最終拷貝數(shù) Nf = N0 （ 1 + Y） N 非特異性產(chǎn)物或引物二聚體對(duì)反應(yīng)試劑的競爭作用 反應(yīng)試劑的穩(wěn)定性 擴(kuò)增產(chǎn)物抑制作用 高濃度產(chǎn)物的退活作用以及不完全變性 特異性的改進(jìn)： 降低循環(huán)次數(shù)，減小擴(kuò)增片段長度。較長 PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增需要相應(yīng)延長反應(yīng)時(shí)間，但最好要 比理論計(jì)算時(shí)間更長些，以彌補(bǔ)由于反應(yīng)系統(tǒng)粘度增大所產(chǎn)生的反 應(yīng)滯后作用。過長的退火時(shí)間在正常情況下并不能提高產(chǎn)量， 只會(huì)增加非特異性引物雜交的可能性。不同 DNA聚合酶所擁有的 Tm值的差異 會(huì)改變有效的引物退火溫度。 預(yù)熱變性溫度和時(shí)間 預(yù)熱溫度和時(shí)間 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 92 96℃ 30 secs 10 mins 在酶不存在時(shí)，預(yù)熱能滅活樣品中有害的蛋白酶和核酸酶，同時(shí) 又能保證模板的完全變性，尤其是基因組 DNA直接作為模板使用 時(shí)，更顯得重要。因此， PCR反應(yīng)系統(tǒng)的 主要優(yōu)化參數(shù) 是 Mg+2的濃度，尤其當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物大 大于 1kb時(shí)，這個(gè)因素顯得更為重要。 由于 Mg+2 能與 dNTPs形成可溶性的復(fù)合物，過低濃度的 Mg+2離子將會(huì)影響 dNTPs的有效濃度。 準(zhǔn)確性的改進(jìn)：
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