聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件(參考版)
2025-01-08 16:46本頁面
【正文】 。 RAPD (Random amplified polymorphism DNA) ④ 在醫(yī)學(xué)上診斷的應(yīng)用 現(xiàn)在無認(rèn)是艾滋病、癌癥等 遺傳性疾病 ，還是 傳染性疾病 ，很多均已建立起了PCR檢測技術(shù)平臺，只需對病人的血液DNA進(jìn)行一定的 PCR反應(yīng)，就可進(jìn)行相應(yīng)診斷，在嚴(yán)格操作條件的情況下比其它方法簡便靈敏。 ② 基因的體外誘變 利用 6bp長度的隨機(jī)序列引物擴(kuò)增細(xì)胞中的總 DNA，將會(huì)得到許多非特異性產(chǎn)物，反映了該引物序列在基因組中的分布狀況。 ? 探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收； ? PCR擴(kuò)增時(shí)， Taq酶的 5’－ 3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，每擴(kuò)增一條 DNA鏈，有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR產(chǎn)物形成完全同步。因此，只要獲得未知樣品的 Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 SDcycle 315 Ct值的確定 相同模板在同一臺 PCR儀上進(jìn)行 96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖 終點(diǎn)處檢測產(chǎn)物量不恒定； Ct值則極具重現(xiàn)性 （ 3） Ct值與起始模板的關(guān)系 ? 研究表明，每個(gè)模板的 Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多， Ct值越小。 ① 含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 RNA template 3’ 5’ 下游引物 cDNA first strand 3’ 5’ 上游引物 cDNA first strand cDNA second strand 3’ 5’ 3’ 5’ 反轉(zhuǎn)錄酶 Taq酶 PCR Reverse transcription (RT) 下游引物 上游引物 Taq酶 小牛腸磷脂酶 煙草酸性焦磷酸酶 ⑨ 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 常規(guī)定量 PCR技術(shù)： — 對 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量 — 重復(fù)性差 — 半定量 實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)： 對 PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行 定量 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR原理 ? 在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè) PCR進(jìn)程，最后通過 標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。 ⑦ 兼并引物 PCR（ Degenerate Primer） ⑧ RTPCR（ reverse transcriptionPCR） 在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下 、 以 mRNA為模板合成互補(bǔ)的 cDNA， 再以 cDNA為模板進(jìn)行 PCR反應(yīng) 。設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)盡量選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物 3’末端兼并，因?yàn)?339。 兼并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。 template template 3’ 5’ 5’ 3’ （傳統(tǒng) PCR只擴(kuò)增兩個(gè)引物質(zhì)之間的已知序列）。 ⑤ 錨定 PCR： 錨定 PCR是 在未知 DNA cDNA片段的一個(gè)末端人工接上一個(gè)已知序列片段 ,利用一個(gè)基因特異引物與這個(gè)人工序列區(qū)引物（錨定引物）進(jìn)行擴(kuò)增，所以它是一種半特異性擴(kuò)增。 3’ 5’ 5’ 3’ 引物少 用于擴(kuò)增單鏈 DNA，單鏈 DNA更適于測序。 準(zhǔn)確配對引物 錯(cuò)配引物 共同引物 PCR oror模板 模板 o r ④ 不對稱 PCR 低濃度的引物（限制引物）首先被用完，隨后只有高濃度的引物，繼續(xù)合成單鏈 DNA。 ② 降落 PCR ③ 競爭引物 PCR ： 有一個(gè)堿基變化的兩種引物在較寬松的復(fù)性條件下競爭 DNA模板，其中只
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