多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增dna片斷(參考版)
2025-05-29 06:19本頁面
【正文】 書后題 。 ： PCR引物是根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo) DNA的堿基序列來設(shè)計(jì)的。 PCR反應(yīng)中的目的片段一般以 2n的方式積累，其中 n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳 ,經(jīng)溴化乙錠染色 ,在紫外燈照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的 DNA帶 。 五、實(shí)驗(yàn)小結(jié) PCR儀加熱使 （ ） 變性 , 復(fù)性使引物與模板 DNA（ ） ,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫 ( ),在 （ ） 的作用下 ,以 （ ） 為原料 ,以 （ ） 為復(fù)制的起點(diǎn) ,合成新鏈 。 ②樣品中存在靶基因的同源序列也可能造成假陽性結(jié)果。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出 PCR技術(shù)的特點(diǎn) 細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外 DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別 體內(nèi) DNA的復(fù)制 體外的模擬 模板（母鏈） 細(xì)胞內(nèi)源 外源加入 引物 引物合成酶 外源加入 底物 dNTP 細(xì)胞內(nèi)源 外源加入 聚合酶 細(xì)胞內(nèi)源 外源加入 反應(yīng)環(huán)境 細(xì)胞內(nèi)環(huán)境 緩沖液 ① PCR過程需要的引物是 RNA或 DNA，而是人工合成的 DNA單鏈，其長度通常為 20－ 30個(gè)脫氧核苷酸 細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和 PCR不同點(diǎn) ② PCR過程中 DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的 細(xì)胞內(nèi) DNA的復(fù)制 PCR 不同點(diǎn) 解旋 解旋酶，邊解旋邊復(fù)制 80～ 100℃ 高溫解旋，雙鏈完全分開 酶 DNA解旋酶， DNA聚合酶，DNA連接酶 TaqDNA聚合酶 引物 RNA DNA或 RNA 能量 ATP 不加 溫度 體內(nèi)溫和條件 高溫 子鏈合成 一條鏈連續(xù)（先導(dǎo)鏈），另一條鏈不連續(xù)，先合成片段，再由 DNA連接酶連接（滯后鏈） 兩條子鏈均連續(xù)合成 相同點(diǎn) ① 需要提供 DNA復(fù)制模板 ②四種脫氧核苷酸作為原料 ③子鏈延伸的方向都是從 5’端到 3’端 細(xì)胞內(nèi) DNA的復(fù)制與 PCR的比較 DNA聚合酶與 DNA連接酶的異同 DNA聚合酶 DNA連接酶 不同點(diǎn) 作用 單個(gè)核苷酸加到已有的單鏈片段的 3’羥基上 連接兩條 DNA片段的缺口 是否需要模板 需要 不需要 相同點(diǎn) 都是形成磷酸二酯鍵 （五） PCR的反應(yīng)過程 PCR的反應(yīng)步驟 PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟 ── 變性、復(fù)性和延伸 ① 變性（模板 DNA解旋） 模板 DNA經(jīng)加熱至 900C以上。 Taq DNA聚合酶的應(yīng)用 緩沖液需要為 PCR反應(yīng)提供的物質(zhì) DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的 DNA聚合酶，同時(shí)通過控制溫度使 DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。 DNA變性所需要的溫度和時(shí)間取決于 DNA的復(fù)雜性、 GC含量、擴(kuò)增儀和種類和 PCR反應(yīng)的體積等 。哺乳動(dòng)物基因組 DNA中 GC含量在 40%時(shí)，解
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