聚合酶鏈式反應(yīng)ppt課件-資料下載頁
2025-01-05 16:46本頁面
【正文】 CR技術(shù)： — 對 PCR擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進行定量 — 重復(fù)性差 — 半定量 實時定量 PCR技術(shù)： 對 PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)的產(chǎn)物進行 定量 實時熒光定量 PCR原理 ? 在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR進程，最后通過 標準曲線對未知模板進行定量分析。 （ 1） Ct 值 ① 是熒光定量 PCR技術(shù)的一個很重要的概念 C代表 Cycle， t代表 threshold(熒光域值 )。 ① 含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 （ 2）熒光域值（ threshold）的設(shè)定 ? PCR反應(yīng)的前 15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號 ? 熒光域值是 315個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的 10倍，即： threshold = 10 180。 SDcycle 315 Ct值的確定 相同模板在同一臺 PCR儀上進行 96次擴增的擴增曲線圖 終點處檢測產(chǎn)物量不恒定； Ct值則極具重現(xiàn)性 （ 3） Ct值與起始模板的關(guān)系 ? 研究表明，每個模板的 Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多， Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代 Ct值。因此，只要獲得未知樣品的 Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 熒光定量標準曲線 （ 4）熒光化學 熒光定量 PCR所使用的熒光化學可分為兩種： — 熒光探針 — 熒光染料 TaqMan熒光探針 ? 與目標序列互補的 寡核苷酸探針 ? 兩端分別標記一個 報告熒光基團 (熒光素 )和一個 淬滅熒光基團 (淬滅劑 )。 ? 探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收； ? PCR擴增時， Taq酶的 5’－ 3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，每擴增一條 DNA鏈，有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR產(chǎn)物形成完全同步。 特異性強： 具有引物和探針的雙重特異性 重復(fù)性好： 同一標本的 Ct值相同 敏感性高： 可檢測百萬分之一個感染細胞或 10病毒 DNA分子 線性范圍廣 ：定量的動態(tài)范圍達 56個數(shù)量級，因而 相差較大的 DNA起始拷貝數(shù)也不需稀釋 工作效率高 ：一次定量 96個樣品僅需 12h 但儀器及 配套試劑極其昂貴 實時熒光定量 PCR的特點 ① DNA克隆 聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)應(yīng)用 利用引物的 5‘端序列不要求與模板嚴格配對，設(shè)計引物時引入突變序列。 ② 基因的體外誘變 利用 6bp長度的隨機序列引物擴增細胞中的總 DNA，將會得到許多非特異性產(chǎn)物，反映了該引物序列在基因組中的分布狀況。 ③ 基因組的比較研究 比較不同物種之間的基因組特征和相似性。 RAPD (Random amplified polymorphism DNA) ④ 在醫(yī)學上診斷的應(yīng)用 現(xiàn)在無認是艾滋病、癌癥等 遺傳性疾病 ，還是 傳染性疾病 ，很多均已建立起了PCR檢測技術(shù)平臺，只需對病人的血液DNA進行一定的 PCR反應(yīng)，就可進行相應(yīng)診斷，在嚴格操作條件的情況下比其它方法簡便靈敏。 ⑤ 在法醫(yī)學上的應(yīng)用 第一類法醫(yī)學 PCR應(yīng)用是利用上面所述的分子標記多態(tài)性即 指紋圖譜 揭示兩外或多個生物樣品之間的親緣關(guān)系，第二類是上述所述醫(yī)學論斷 結(jié)論在法醫(yī)學上的應(yīng)用，這在確定犯罪嫌疑人、確定當事人親緣關(guān)系等方面具有廣泛應(yīng)用前景。
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