聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ppt課件(已修改)
2025-01-17 16:46 本頁面
【正文】 第四章 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 聚合酶鏈反應(yīng) ( Polymerase Chain Reaction, PCR)是 80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。 ? 1971年 ， Khorana提出： DNA經(jīng)過變性 ， 與合適引物雜交 ， 用 DNA聚合酶延伸引物 ， 并不斷重復(fù)該過程便可克隆 tRNA基因 。 ? 但由于測(cè)序和引物合成的困難 ，以及 70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能 ， 所以 ，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了 … PCR技術(shù)簡史 PCR技術(shù)簡史 ? 1985年 ， 美國 PECetus公司 Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng) （ PCR） ? 基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制 ? 最初采用 Ecoli DNA 聚合酶 I 的Klenow片段進(jìn)行 PCR， PCR技術(shù)簡史 ? 1988年 Saiki 等從水生嗜熱桿菌中提取到一種耐熱 Taq DNA聚合酶 ? Taq DNA聚合酶的應(yīng)用使得 PCR能高效率的進(jìn)行 ， PECetus公司推出了第一臺(tái) PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀 。 ? 1993年 ， Mullis因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 72℃ 94℃ 55℃ PCR循環(huán) PCR儀 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)原理 模板 DNA變性 引物 DNA復(fù)性 引物 DNA延伸 PCR 雙鏈 DNA在受熱后，配對(duì)堿基的氫鍵斷裂， DNA兩條鏈分開成為單鏈。 TGCATGCAT ATCTTGAAC TAGAACTTG ACGTACGTA TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ TAGAACTTG ACGTACGTA95oC （ 1） DNA模板變性 模板 模板（ template） 95oC TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ TAGAACTTG ACGTACGTA 3’ 人工合成的單鏈 DNA小片斷，堿基順序分別與所要擴(kuò)增的模板 DNA雙鏈的 5‘端相同。 （ 2） DNA模板與引物復(fù)性 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ 3’ ACGTACGTA 5’ 3’ 引物 引物 引物（ primer） : 4065oC DNA聚合酶按堿基配對(duì)原則延伸 DNA鏈。 （ 3） DNA鏈的延伸 TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ TAGAACTTG ACGTACGTA 3’ 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ ACGTACGTA 5’ Taq Taq 72oC 理論上 2530次循環(huán)就可以合成 225230條 DNA。 變性 — 復(fù)性 — 延伸。 （ 5） 1個(gè)循環(huán)的結(jié)果 （ 4）新一輪循環(huán)開始 PCR反應(yīng)曲線 PCR的過程 （ 1）第一步 變性（ denature） 9495 oC下 5分鐘，模板 DNA雙鏈完全變性成單鏈。 （ 2）第二步 復(fù)性（ anneal） 5060 oC下 1分鐘，引物與模板復(fù)性。 ① 引物的濃度高， ② 引物的鏈短。 94 oC下 1分鐘，新合成的 DNA雙鏈又變性成單鏈模板。 （ 4）第四步 變性（ denature） 72 oC下 12分鐘， Taq DNA聚合酶在引物的 3‘端上加上核苷酸。 （ 3）第三步 延伸（ extend） （ 5）第五步 重復(fù)（ repeat） 第二步 —— 第三步 —— 第四步 復(fù)
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