聚合酶鏈式反應(yīng)ppt課件-展示頁
2025-01-14 16:46本頁面
【正文】 活性，但沒有 3‘?5’外切酶活性。 標準的 PCR反應(yīng)體系 10 擴增緩沖液 10ul 4種 dNTP混合物 各 200umol/L 引物 10～ 100pmol 模板 DNA ～ 2ug Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加雙或三蒸水至 100ul 自從 . Erilish分離出耐高溫的 Taq DNA聚合酶，代替大腸桿菌 DNA聚合酶 Klenow片斷（ 37 oC )， PCR技術(shù)才進入實用階段。 不需要純化，甚至可以直接用細菌。 （ 5）可以擴增 mRNA （ 4）簡便 先用逆轉(zhuǎn)錄酶將 mRNA合成 cDNA，再以 cDNA為模板進行擴增。提高了反映的特異性。 ② 延伸過程是在高溫下進行。 （ 3）第三步 延伸（ extend） （ 5）第五步 重復(fù)（ repeat） 第二步 —— 第三步 —— 第四步 復(fù)性 延伸 變性 95oC 5min 50oC 1min 72oC 2min 94oC 1min 溫度循環(huán) 需要的模板量極低。 94 oC下 1分鐘，新合成的 DNA雙鏈又變性成單鏈模板。 （ 2）第二步 復(fù)性（ anneal） 5060 oC下 1分鐘，引物與模板復(fù)性。 變性 — 復(fù)性 — 延伸。 （ 2） DNA模板與引物復(fù)性 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ 3’ ACGTACGTA 5’ 3’ 引物 引物 引物（ primer） : 4065oC DNA聚合酶按堿基配對原則延伸 DNA鏈。 ? 1993年 ， Mullis因此項技術(shù)獲諾貝爾化學獎 72℃ 94℃ 55℃ PCR循環(huán) PCR儀 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)原理 模板 DNA變性 引物 DNA復(fù)性 引物 DNA延伸 PCR 雙鏈 DNA在受熱后，配對堿基的氫鍵斷裂， DNA兩條鏈分開成為單鏈。 ? 1971年 ， Khorana提出： DNA經(jīng)過變性 ， 與合適引物雜交 ， 用 DNA聚合酶延伸引物 ， 并不斷重復(fù)該過程便可克隆 tRNA基因 。第四章 聚合酶鏈式反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng) ( Polymerase Chain Reaction, PCR)是 80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點。 ? 但由于測序和引物合成的困難 ，以及 70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能 ， 所以 ，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了 … PCR技術(shù)簡史 PCR技術(shù)簡史 ? 1985年 ， 美國 PECetus公司 Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng) （ PCR） ? 基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復(fù)制 ? 最初采用 Ecoli DNA 聚合酶 I 的Klenow片段進行 PCR， PCR技術(shù)簡史 ? 1988年 Saiki 等從水生嗜熱桿菌中提取到一種耐熱 Taq DNA聚合酶 ? Taq DNA聚合酶的應(yīng)用使得 PCR能高效率的進行 ， PECetus公司推出了第一臺 PCR自動化熱循環(huán)儀 。 TGCATGCAT ATCTTGAAC TAGAACTTG ACGTACGTA TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ 3’ 3’
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