聚合酶鏈反應(yīng)-展示頁
2024-08-20 16:17本頁面
【正文】 應(yīng)（在PCR儀上進(jìn)行）；(6) 反應(yīng)終止后，取樣品進(jìn)行凝膠電泳，Southern雜交或DNA序列分析以鑒定是否得到特異的擴(kuò)增產(chǎn)物。(1) 反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)通過三種溫度的交替循環(huán)來進(jìn)行，一般94℃變性30秒，55℃退火 30秒，7072℃延伸3060秒，依此條件進(jìn)行30次左右的循環(huán)。通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸3個溫度的循環(huán)，模板上介于兩個引物之間的片段不斷得到擴(kuò)增。這樣，目的的DNA的數(shù)量將以2n 2n的形式累積，在2小時內(nèi)可擴(kuò)增30(n)個循環(huán)， DNA量達(dá)原來的上百萬倍。模板DNA變性、引物結(jié)合(退火)、引物延伸合成 DNA這三步構(gòu)成一個PCR循環(huán)。1. PCR的基本原理和過程 PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧單核苷酸存在的條件下依賴于耐高溫的DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。核酸擴(kuò)增 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)由美國Centus公司的Kary Mullis發(fā)明，于1985年由Saiki等在Science雜志上首次報道，是近年來開發(fā)的體外快速擴(kuò)增DNA的技術(shù)。通過PCR可以簡便、快速地從微量生物材料中以體外擴(kuò)增的方式獲得大量特定的核酸，并且有很高的靈敏度和特異性，可在動物檢疫中用于微量樣品的檢測。PCR以欲擴(kuò)增的DNA做為模板，以和模板正鏈和負(fù)鏈末端互補(bǔ)的兩種寡聚核苷酸做為引物，經(jīng)過模板DNA變性、模板引物復(fù)性結(jié)合、并在DNA聚合酶作用下發(fā)生引物鏈延伸反應(yīng)來合成新的模板DNA。每一循環(huán)的DNA產(chǎn)物經(jīng)變性又成為下一個循環(huán)的模板 DNA。PCR三步反應(yīng)中，變性反應(yīng)在高溫中進(jìn)行，目的是通過加熱使DNA雙鏈解離形成單鏈；第二步反應(yīng)又稱退火反應(yīng)，在較低溫度中進(jìn)行，它使引物與模板上互補(bǔ)的序列形成雜交鏈而結(jié)合上模板；第三步為延伸反應(yīng)，是在4種dNTP底物和Mg2+ 存在的條件下，由DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈的延伸反應(yīng)。對擴(kuò)增產(chǎn)物可通過凝膠電泳、Southern雜交或DNA序列分析進(jìn)行檢測。(2) PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系一般選用50100μl體積，其中含有：50mmol/L KCl，10mmol/L (室溫，)，(BSA)，2種引物，(mol/L，4種脫氧核糖核苷酸底物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)各200( mol/L，模板 DNA (g?！CR可擴(kuò)增雙鏈DNA和單鏈DNA，并能以RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR以擴(kuò)增cDNA。除反轉(zhuǎn)錄PCR外，尚有不對稱PCR、反向PCR、錨定PCR、多重PCR、著色互補(bǔ)PCR、免疫PCR和套式PCR等。在PCR體系中先引入反轉(zhuǎn)錄酶，將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA做為PCR的模板，加入引物和Taq DNA聚合酶按正常PCR方式擴(kuò)增 cDNA。(2) 錨定PCR(Anchored PCR) 通常進(jìn)行的PCR試驗
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