聚合酶鏈式反應(yīng)ppt課件-文庫吧資料
2025-01-11 16:46本頁面
【正文】 有完全互補的引物才能大量配對。其原理是，隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經(jīng)擴增出來，其濃度遠遠超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴增。 引物 5′ 端修飾技術(shù) 修 飾 法 用 途 附加核酸序列： 酶切位點 克?。ㄈ缍ㄏ蚩寺。? 噬菌體啟動子 合成 RNA探針、測序 蛋白質(zhì)結(jié)合序列 產(chǎn)物純化、檢測 核糖體結(jié)合序列 高效表達 其它 構(gòu)建載體、重組子等 聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)類型 ① 巢式 PCR： 是為了增加擴增的靈敏度 ,對已知序列設(shè)計出第一對引物 ,擴增 25個循環(huán) ,然后根據(jù)序列設(shè)計第二對引物 (在第一對引物內(nèi)部 ),如此擴增 ,不受平臺效應(yīng)限制 ,靈敏度高。 ?避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的序列 。 ?Mg2+對 PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響 ?在一般的 PCR反應(yīng)中， dNTP濃度 200umol/L時，Mg2+濃度為 ～ mmol/L為宜 ?Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增， 濃度過低會降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少 （ 5） Mg2+ ① 一定范圍內(nèi)提高退火溫度； ② 縮短退火和延伸時間 ， 可減少錯誤引發(fā)及 多余的 DNA聚合酶參與酶促延伸的機會； ③ 降低引物和酶的濃度可以減少錯誤引發(fā) ， 尤其是能減少引物二聚體的引發(fā)； ④ 改變 Mg2+的濃度； 提高 PCR擴增的特異性 ⑤ 引物設(shè)計的特異性； ⑥ 減少循環(huán)次數(shù)； ⑦ 熱啟動 （ Hot Start） ⑧ 采用二對引物即外引物和內(nèi)引物進行擴增來 提高擴增的特異性 。 ② 模板的量： 不能太多， 100?l反應(yīng)體系中 100ng足夠。增加擴增產(chǎn)物的特異性。這樣的混合引物稱簡并引物。 ⑦簡并引物 如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列反推出來的，就必須考慮密碼的簡并性。 實際復(fù)性溫度選擇低于 Tm值 5 oC。 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’ 3’CAGGACTTAGTCACT5’ primer1 primer2 Upstream primer vs Downstream primer Sense primer vs Antisense primer Primer1 vs Primer2 Forward primer vs Reverse primer ⑤引物的 Tm值 Tm=（ G+C)?4 + (A+T)?2 當引物中的（ G+C）含量低于 50%時，復(fù)性溫度低于 55 oC。 5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’ 3’GCTAGCTACTTAAG5’ 3‘端必須與模板正確配對， 5’端可以不配對。 一般引物設(shè)計為長 15— 30bp。 （ 2）引物（ primer) ①位置 3’ 3’ 即 ?1011 bp的基因組中有一次完全與 19個核苷酸的序列相同的機會（或機會是約 2 1011）。 ④ Taq DNA聚合酶的激活劑 50mmol/L KCl也能激活 Taq DNA聚合酶的活性。 金屬離子敏感（尤其是 Mg2+ ）。 ① 熱穩(wěn)定性 最適溫度： 7278 oC 延伸速度： 約 1000nt/min酶分子 最長延伸長度： ② 最適溫度高 ③ Taq酶的功能缺點 具有 5’?3’聚合酶活性和 5’?3’外切酶
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