聚合酶鏈反應及其應用-文庫吧資料
2025-06-01 18:12本頁面
【正文】 降低 dNTPs的濃度，但要注意 Mg+2的摩爾濃度 也應同步降低。此外，保 持四種 dNTPs的濃度 略高于 DNA聚合酶對各種 dNTPs的 Km值也 很重要（ 1015 mM）。 對的堿基，則適當降低引物的濃度。 引物的在線設計工具及免費軟件簡介 其它的在線設計網(wǎng)站 WWW GeneFisher Web Primers Project DOPE2 NetPrimer OligosULike Primers3 PCR引物的使用 PCR引物 的標準使用范圍： mM， 最好 mM 特異性的改進： 降低 引物 和 dNTP的濃度可以在很大程度上改 有效性的改進： 增加引物與模板的分子比； 如果引物中有不配 善 PCR擴增反應的特異性，高濃度的引物往往會導致非特異性 的退火及副產(chǎn)物形成，同時也會促進引物二聚體的產(chǎn)生。而且能根據(jù)三種計 算方法顯示正反向引物的 Tm值，可以隨意更換堿基以提高或降低 Tm值 同時還能提供引物穩(wěn)定性的參數(shù)，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體、引物相 似性等。但 TPG的一個明顯缺陷是不能計算引物的 Tm值并判斷其穩(wěn)定性。 引物的在線設計工具及免費軟件簡介 The Primer Generator（ TPG） TPG是一種基于 CGI數(shù)據(jù)庫便利的用于定點突變的引物設計工具。 引物 3’ 端 子序列也是隨機多樣性的。 盡可能高的互補程度是必要的。 為擴增后操作提供便利條件 在不影響擴增反應特異性的前提下，可在引物的 5’ 端引入諸如限 限制性內(nèi)切酶識別位點、啟動子序列等有用的非模板序列，以便于擴 增后操作。如果兩條引物的退火溫度差別過大，可以適當延長 較低 Ta值 的引 物的 3’ 端（這樣可以保持擴增產(chǎn)物的長度不變）或 5’ 端。如果因靶序列的原因，引物不得不含有 過高 的 GC堿基，那么就 在其 5’ 端設計一串 A或 T； 同樣，如果引物中的 AT含量過高，就在其 5’ 端設計一串 G或 C， 以便將整條引物的 GC含量控制在合適的范圍內(nèi)。 PCR引物的設計原則 4 PCR的引物設計及合成 PCR引物的使用 引物的在線設計工具及免費軟件簡介 PCR引物的設計原則 選擇合適的引物是 PCR實驗設計的重要步驟，合適引物最基本的 引物的長度 標準就是與靶序列的 高特異性雜交 。 PCR模板的來源主要有兩大類： 純凈物 如重組質(zhì)粒、制備的染色體 DNA、 回收的 DNA片段 粗樣品 如糞便、腦脊髓液、血液、食物、動物貝殼、土壤、 尿液、唾液、福爾馬林固定劑、組織切片、膿汁、噴 嚏液、痰液等 上述粗樣品 含有大量的 PCR反應抑制物質(zhì)，因此如何 去除 這些種類 繁多的 抑制劑 或者 添加 必要的 PCR反應 增強劑 顯得十分重要。 聚合酶的濃度是決定 PCR反應成本的 的重要參數(shù)，濃度 過高不僅能降特異性，同時也導致不必要的消耗。 出錯率 比 Vent DNA聚合酶低 2 倍； 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 UlTma是一種高保真的 DNA聚合酶，可以較高的產(chǎn)量擴增小于 3 kb的 DNA靶序列，產(chǎn)物呈平頭末端。 X 10–7 X 10–6 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Vent DNA聚合酶具有 3’ →5 ’ 的核酸外切酶活性和校正功能，因此 與其它 DNA聚合酶（如 Taq酶 ）相比，具有相對較好的高保真性，其 出錯率為 X 10–5 X 10–5 ； Vent DNA聚合酶（ Thermococcus litoralis） 度小于 2 kb時，擴增產(chǎn)物的長度與 Mg2+的濃度并無關(guān)聯(lián)； 如果擴增長度大于 2 kb， 則需要高于 2 mM的 Mg2+， 而在擴增長 如果模板鏈中存在次黃嘌呤核苷或脫氧尿嘧啶核苷， Vent DNA 聚合酶不能延伸引物。 反應條件； 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Tth DNA聚合酶在 Mn2+的存在下，能有效地反轉(zhuǎn)錄長度在 1000堿 基以下的 RNA； Tth DNA聚合酶在 Mg2+的存在下，能由 DNA模板合成 DNA； Tth DNA聚合酶（ Thermus thermophilus） 好地克服 RNA鏈中普遍存在二級結(jié)構(gòu)的難題。 Taq DNA聚合 酶催化的聚合反應的普遍 則 Taq DNA酶還常常導致擴增產(chǎn)物的缺失突變。 DNA聚合 酶的堿基摻入錯誤可能發(fā)生在其延伸階段的五種活性： 與 dNTP的結(jié)合特異性 磷酸二酯鍵的形成速率 焦磷酸的釋放速率 堿基錯誤摻入之后的持續(xù)延伸性 3’ →5 ’ 的核酸外切活性的強弱 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Taq DNA酶的聚合出錯率較高（ ），因為它沒有 3’ →5 ’的 的核酸外切酶活性和校正功能。 PCR反應的 準確率遠遠低于細胞內(nèi)的 DNA聚合反應，除了缺少完善的 DNA聚合校 正系統(tǒng)外，影響 PCR反應 準確率的因素還包括： DNA聚合酶的保真性能（主要因素） DNA鏈的物理損傷 PCR反應體系的潔凈度 DNA聚合酶對 PCR精確性的重要影響 DNA聚合酶的保真性主要取決于其 3’ →5 ’ 的核酸外切酶活性，它 負責對錯誤摻入的堿基進行校正。 PCR技術(shù)的基本原理 5‘ 5‘ 待擴增 DNA區(qū)域 5‘ 變性 加熱
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