聚合酶鏈反應(yīng)-文庫吧資料
2024-08-18 16:17本頁面
【正文】 原檢疫方面，應(yīng)用常規(guī)技術(shù)難于得到確切結(jié)果，甚至漏檢，而用PCR技術(shù)可使未形成病毒顆粒的DNA或RNA或樣品中病原體破壞后殘留核酸分子迅速擴(kuò)增而測定，且只需提取微量DNA分子就可以得出結(jié)果。這種采用多對成套引物，逐步擴(kuò)增DNA內(nèi)側(cè)片段的PCR就稱為套式PCR。如果在原來的引物內(nèi)側(cè)重新設(shè)計(jì)一對引物，再進(jìn)行新一輪PCR，則很容易獲得更大量的DNA產(chǎn)物。(8) 套式PCR(Nested PCR) 普通PCR的產(chǎn)物DNA往往需要再擴(kuò)增，以便對之進(jìn)行進(jìn)一步鑒定、分子克隆或用作其他用途。被聯(lián)接的已知片段DNA相當(dāng)于指示劑，無論檢測對象是什么，只需合成針對這段DNA的引物即可；⑤ 省去了普通PCR實(shí)驗(yàn)檢測RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄過程，即增加了靈敏度又降低了實(shí)驗(yàn)成本。它的原理是通過應(yīng)用一個對DNA和抗體具有雙重結(jié)合活性的聯(lián)接分子使二者聯(lián)接起來，這樣就可以使作為指示系統(tǒng)的DNA分子通過抗體而特異性地結(jié)合到抗原上，從而形成一種特異性“抗原－抗體－DNA復(fù)合物”，再通過對其中已知片段DNA的PCR擴(kuò)增，即可證明抗原存在與否。這一技術(shù)為PCR技術(shù)的臨診自動化診斷打下了基礎(chǔ)。反應(yīng)結(jié)束后除去多余引物，擴(kuò)增產(chǎn)物在紫外線照射下能顯示某一種或幾種熒光染料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)帶缺失，則會缺乏相應(yīng)的顏色。(6) 著色互補(bǔ)PCR(Colour plementation assay) 著色互補(bǔ)PCR又稱熒光PCR(Fluroscent PCR)。目前報道的多重PCR反應(yīng)，最多可同時擴(kuò)增12條區(qū)帶。在同一反應(yīng)管中加入多對引物，擴(kuò)增同一模板的多個區(qū)域。(5) 多重PCR(Multiplex PCR) 應(yīng)用PCR技術(shù)可檢測特定序列的存在或缺失。(4) 不對稱PCR(Asymmetric PCR) 不對稱PCR又稱單鏈擴(kuò)增PCR。(3) 反向PCR(Inverse PCR) 常規(guī)PCR是擴(kuò)增兩個已知序列之間的DNA片段，反向PCR則用于擴(kuò)增位于已知序列兩側(cè)的一段未知序列。當(dāng)欲擴(kuò)增的片段序列未知時，可通過錨定PCR進(jìn)行擴(kuò)增。這一技術(shù)廣泛應(yīng)用于RNA和RNA病毒的檢測。(1) 反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT－PCR) RT－PCR用于擴(kuò)增RNA樣品。經(jīng)不斷發(fā)展和完善，已有多種衍生PCR技術(shù)。 一個典型的PCR反應(yīng)可按以下步驟進(jìn)行:(1) :滅菌雙蒸水30μl10擴(kuò)增緩沖液10μl4種dNTP混合物，引物15μl(100pmol)引物25μl(100pmol)模板DNA2μl加滅菌雙蒸水至終體積100μl(2) 置94℃加熱5分鐘；(3) Taq DNA聚合酶(5iu/μl)加入反應(yīng)混合液中；(4) 將100μl輕礦物油加入混合液表面，以防水分蒸發(fā)；(5) 按所設(shè)定的反應(yīng)條件進(jìn)行循環(huán)反
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