廣西地方標準豬藍耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鑒別檢測多重?zé)晒舛糠崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法征求意見稿-文庫吧資料
2024-09-02 18:44本頁面
【正文】 +）；反之，判定為 HPPRRSV 陰性，記為 HPPRRSV（）。反之，此次檢測無效?！≠|(zhì)控標準 陰性對照樣品 Ct 值36?！￡幮詫φ沼? 滅菌雙蒸水代替模板作為陰性對照模板。用核酸蛋白分析儀測定其光吸收值( OD260nm )后計算濃度，用滅菌雙蒸水稀釋至?106 拷貝/μL，作為陽性對照標準品，20 ℃ 保存?zhèn)溆?。病毒細胞培養(yǎng)物的處理、。注：某些商業(yè)公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀需加入ROX參比染料。加完試劑后瞬時離心混勻。L；i）滅菌雙蒸水：補足總體積至 25 181。L）：1 181。L）： 181。L）： 181。L）：各 1181。L）：各 181。L；b）ROX 參比染料 II： 181。L。獲得的 ?cDNA?直接用于?熒光定量 PCR 擴增，或置20 ?℃?保存?zhèn)溆谩?PCR?反應(yīng)管置于普通 PCR 儀內(nèi)進行反轉(zhuǎn)錄。L。L； g）待檢總 RNA 模板：4 181。L；f）隨機引物?9?聚體（50?pmol/181。L）：?181。L；c）dNTP?混合物（各?10?mM/L）：1?181。L；b）AMV?反轉(zhuǎn)錄酶（5 U/181。L。L 待檢樣品于無 RNA 酶的 mL 離心管中，按照 RNA 提取試劑盒操作說明書抽提總 RNA 。血清樣品可直接用于總 RNA 抽提，或置 20 ℃ 保存?zhèn)溆??！〈龣z樣品處理采取病豬的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等組織共約 1 g，置于 mL 離心管中，加入滅菌的 1 mol/L PBS（pH ）1 mL，用組織勻漿機充分研磨后，反復(fù)凍融 3 次；細胞培養(yǎng)物則直接反復(fù)凍融 3 次。否則，應(yīng)在使用前經(jīng) DEPC水處理，然后用 10 5 Pa 高壓滅菌 30 min?！∫淮涡院牟囊淮涡院牟陌ǎ篴）乳膠手套；b）離心管；c）PCR 反應(yīng)管；d）吸頭；e）熒光 PCR 反應(yīng)管?！晒舛?PCR 試劑盒商業(yè)化的熒光定量 PCR 試劑盒主要成分見附錄?B 中的 ，使用前經(jīng)技術(shù)驗證合格?！NA 抽提試劑盒商業(yè)化的 RNA?抽提試劑盒主要成分見附錄?B 中的 ，使用前經(jīng)技術(shù)驗證合格。上、下游引物及探針的使用濃度均為?25?pmol/181。指在同一反應(yīng)體系中加入多對引物及多條標有不同熒光基團的探針，同時擴增多個模板并利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法?！【酆厦告湻磻?yīng) polymerase chain reaction，PCR是一種由熱變性→復(fù)性→延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán)，經(jīng)多次循環(huán)反應(yīng)，在體外快速擴增特定脫氧核糖核酸（DNA）片段的方法。該疫苗株除了在Nsp2 蛋白存在 481位氨基酸 和 533?561位氨基酸 共 30 個氨基酸的不連續(xù)缺失外，在628?747位氨基酸還出現(xiàn)120 個氨基酸的整段缺失?！∝i繁殖與呼吸綜合征病毒野毒株 wildtype porcine reproductive and respiratory syndrome virus，WPRRSV指在臨床上分離的具有致病性的豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲基因型經(jīng)典株或變異株。 豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經(jīng)典株 classical porcine reproductive and respiratory syndrome virus，CPRRSV指在病毒 Nsp2 蛋白第 481 位和第 533?561 位氨基酸未出現(xiàn)缺失的、以 VR2332 毒株為代表的美洲基因型豬繁殖與呼吸綜合征病毒。2 術(shù)語和定義DB45/T 10102022所定義的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。DB45/T XXXXX—XXXX1豬藍耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鑒別檢測 多重?zé)晒舛糠崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法1 范圍本標準規(guī)定了用于鑒別檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型野毒株及疫苗株的多重?zé)晒舛糠崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法的材料準備、操作方法及結(jié)果判定。本標準起草單位：廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心。本標準的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。ICS?B 41 DB 45廣 西 壯 族 自 治 區(qū) 地 方 標 準DB 45/T XXXXX—XXXX 豬藍耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鑒別檢測 多重?zé)晒舛糠崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法Multiplex realtime RTPCR for differential detection of wild and
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