廣西地方標(biāo)準(zhǔn)甘蔗梢腐病的鑒定檢測(cè)方法征求意見稿-文庫(kù)吧資料
2024-09-02 18:46本頁面
【正文】 g/μl，此法適合對(duì)病原菌分離純化并提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)?！?致病性特征注射接種7 d后出現(xiàn)甘蔗梢腐病癥狀，經(jīng)過病原菌的在分離和純化后的菌株與原菌株的病原特征一致，而對(duì)照沒有出現(xiàn)癥狀?！?ITS序列鑒定將各甘蔗產(chǎn)區(qū)分離得到的103個(gè)菌株用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序所得片段長(zhǎng)度485bp～603 bp，將測(cè)序所得的序列經(jīng)過Blast比對(duì)分析，、連同從GenBank下載鐮刀菌屬不同種的ITS序列一起用于系統(tǒng)發(fā)育分析。輕度發(fā)病的蔗梢心部葉片部分腐爛，大部分可以恢復(fù)生長(zhǎng)，中度發(fā)病的蔗梢心葉完全腐爛，形成“死尾蔗”，重度發(fā)病的蔗梢變褐腐爛。被害心葉呈梯形凹凸扭曲，并有縱裂，葉緣和葉尖有紅或黑色的病斑，呈燒焦?fàn)顟B(tài)。出現(xiàn)癥狀后，、純化。長(zhǎng)到3～4片葉時(shí)進(jìn)行接種，將菌液注射至生長(zhǎng)點(diǎn)，接種部位為+1葉葉環(huán)下面1 cm處，當(dāng)看到新葉冒出菌液為止。 致病性測(cè)定 μg/ml的PDA平板上培養(yǎng)78 d，用無菌水沖洗孢子，并用4層紗布過濾去除菌絲，將孢子濃度調(diào)至106～107cfu/ml用于接種。PCR結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠上電泳，目的條帶經(jīng)過回收純化后連接至pMD18T載體系統(tǒng)(TaKaRa公司，詳細(xì)操作見說明書），委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。C延伸10 min，4 186。C退火35 S，72 186。C預(yù)變性4 min；94186?！?基于ITS序列的分子鑒定真菌鑒定通用的引物序列： ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGGITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGCPCR反應(yīng)體系：10PCR Buffer(含Mg2+)，dNTPs（10mM each） μl，Taq ，引物(10μM) μl，40ng模板DNA，用ddH2O補(bǔ)足至25 μl。8 鑒定技術(shù) 鑒定方法 癥狀特征鑒定調(diào)查田間自然發(fā)病的甘蔗，采集不同地點(diǎn)、不同部位、不同品種、不同季節(jié)感病的甘蔗，描述發(fā)病時(shí)的病癥、病狀，根據(jù)癥狀特征可以初步快速判定。瓊脂糖凝膠電泳判斷所提各樣品的DNA質(zhì)量。將盛有DNA的離心管置于超凈工作臺(tái)吹15 min，加入50 181。C冰箱放置30min后，4 186。C，12000 rpm，離心5 min，將上清液至新的離心管中。L的SDS提取液和等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)混合液，劇烈渦旋5 min，4186。C，12000 rpm，離心10 min收集菌絲體。用甘油保存菌種于80℃冰箱。 病原菌DNA提取 μg/ml的PDW培養(yǎng)基上，28 176。菌絲長(zhǎng)出后，根據(jù)菌落形態(tài)的差異，挑取菌絲進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)。 病原菌分離純化取病斑與健康部分交界處的植株組織， cm大小的方塊，在70
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