聚合酶鏈反應及其應用(已修改)
2025-06-07 18:12 本頁面
【正文】 5 2 3 4 1 6 7 8 PCR的原理與反應條件 PCR的 DNA聚合酶與擴增的精確性 PCR的模板及制備 PCR的引物設計及合成 PCR反應的其它控制參數 PCR技術的衍生與發(fā)展 PCR技術在生命科學研究中的應用 PCR技術在臨床醫(yī)學方面的應用 聚合酶鏈反應及其應用 PCR技術的誕生與發(fā)展 1 PCR的原理與反應條件 PCR技術的反應條件 PCR技術的基本原理 PCR反應的質量指標 PCR技術的誕生與發(fā)展 聚合酶鏈反應 （ Polymerase Chain Reaction， PCR ） 又稱為 PCR 擴增技術 ，是一種高效、快速、特異性的體外 DNA聚合程序。 1985年 ， 美國 PEcetus公司人類遺傳研究室的 Kary mullis發(fā)明了具有劃時代意義的 PCR技術； 1988年 ， 美國 PEcetus公司推出世界上第一臺 PCR熱循環(huán)儀，從而使 PCR反應自動化； 1993年 ， Kary mullis因發(fā)明 PCR技術獲得 諾貝 爾化學獎； 1995年 ， 定量 PCR儀誕生，使定量研究 DNA靶序列成為現實。 PCR技術的基本原理 5‘ 5‘ 待擴增 DNA區(qū)域 5‘ 變性 加熱 5‘ 5‘ 引物 退火 5‘ 5‘ 底物 聚合 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 加熱 變性 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 退火 引物 底物 聚合 加熱 變性 引物 退火 底物 聚合 1 2 3 5‘ 5‘ 5‘ PCR技術的反應條件 DNA或 RNA模板 5‘ 5‘ 待擴增 DNA區(qū)域 5‘ 94℃ 5 min 5‘ 5‘ 55℃ 退火 5‘ 5‘ 聚合 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 循環(huán) 2530次 目標 DNA片段達 106107 變性 70℃ DNA引物 DNA聚合酶 dNTPs Mg2+（ 緩沖液） PCR反應的質量指標 PCR反應的質量標準有： 特異性（序列選擇） 有效性（序列產量） 上述三大標準并非由單一因素所決定，因此在 PCR反應中必須 準確性（序列對錯） 對多種參數進行聯合控制和改進，但由于 PCR反應中的各參數往往 是相互影響的，因此任何參數的改進不可能同時滿足特異性、有效 性、準確性。 PCR擴增反應的精確性 2 PCR的 DNA聚合酶與擴增的精確性 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 DNA聚合酶對 PCR精確性的重要影響 DNA聚合酶的使用 PCR擴增反應的精確性 利用 PCR技術擴增 DNA靶序列的一個重要問題是這種 DNA體外聚 合反應的序列忠實程度，即 DNA擴增產物序列的 準確率 。 PCR反應的 準確率遠遠低于細胞內的 DNA聚合反應，除了缺少完善的 DNA聚合校 正系統外，影響 PCR反應 準確率的因素還包括： DNA聚合酶的保真性能（主要因素） DNA鏈的物理損傷 PCR反應體系的潔凈度 DNA聚合酶對 PCR精確性的重要影響 DNA聚合酶的保真性主要取決于其 3’ →5 ’ 的核酸外切酶活性，它 負責對錯誤摻入的堿基進行校正。相關研究結果表明， DNA聚合酶的 出錯率在每輪延伸每核苷酸 X 10–6 X 10–4范圍內。 DNA聚合 酶的堿基摻入錯誤可能發(fā)生在其延伸階段的五種活性： 與 dNTP的結合特異性 磷酸二酯鍵的形成速率 焦磷酸的釋放速率 堿基錯誤摻入之后的持續(xù)延伸性 3’ →5 ’ 的核酸外切活性的強弱 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Taq DNA酶的聚合出錯率較高（ ），因為它沒有 3’ →5 ’的 的核酸外切酶活性和校正功能。然而通過優(yōu)化反應條件，可使 Taq酶的 聚合出錯率降低到原來的 1/3。 Taq DNA聚合 酶催化的聚合反應的普遍 則 Taq DNA酶還常常導致擴增產物的缺失突變。 Taq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） 錯誤類型是由 AT轉換為 GC； 如果模板 DNA具有形成二級結構的可能性 避免稀釋保存 Taq DNA聚合 酶 Taq DNA聚合 酶在室溫下也具有延伸引物的活性 Taq DNA酶在使用時應注意： 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 KlenTaq DNA聚合酶 是一種 N端缺失了 的 Taq DNA聚合酶，因而 沒有 5’ 的核酸外切酶活性； KlenTaq DNA聚合酶 的 Mg2+最佳濃度范圍很寬，因此很容易優(yōu)化 KlenTaq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） 在最佳反應條件下， KlenTaq DNA聚合酶 出錯率為 X 10–5， 性能略優(yōu)于 Taq DNA聚合酶。 反應條件； 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Tth DNA聚合酶在 Mn2+的存在下，能有效地反轉錄長度在 1000堿 基以下的 RNA； Tth DNA聚合酶在 Mg2+的存在下，能由 DNA模板合成 DNA；
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