聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用(已修改)
2025-06-07 18:12 本頁面
【正文】 5 2 3 4 1 6 7 8 PCR的原理與反應(yīng)條件 PCR的 DNA聚合酶與擴(kuò)增的精確性 PCR的模板及制備 PCR的引物設(shè)計(jì)及合成 PCR反應(yīng)的其它控制參數(shù) PCR技術(shù)的衍生與發(fā)展 PCR技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用 PCR技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用 聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用 PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 1 PCR的原理與反應(yīng)條件 PCR技術(shù)的反應(yīng)條件 PCR技術(shù)的基本原理 PCR反應(yīng)的質(zhì)量指標(biāo) PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 聚合酶鏈反應(yīng) （ Polymerase Chain Reaction， PCR ） 又稱為 PCR 擴(kuò)增技術(shù) ，是一種高效、快速、特異性的體外 DNA聚合程序。 1985年 ， 美國 PEcetus公司人類遺傳研究室的 Kary mullis發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的 PCR技術(shù)； 1988年 ， 美國 PEcetus公司推出世界上第一臺(tái) PCR熱循環(huán)儀，從而使 PCR反應(yīng)自動(dòng)化； 1993年 ， Kary mullis因發(fā)明 PCR技術(shù)獲得 諾貝 爾化學(xué)獎(jiǎng)； 1995年 ， 定量 PCR儀誕生，使定量研究 DNA靶序列成為現(xiàn)實(shí)。 PCR技術(shù)的基本原理 5‘ 5‘ 待擴(kuò)增 DNA區(qū)域 5‘ 變性 加熱 5‘ 5‘ 引物 退火 5‘ 5‘ 底物 聚合 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 加熱 變性 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 退火 引物 底物 聚合 加熱 變性 引物 退火 底物 聚合 1 2 3 5‘ 5‘ 5‘ PCR技術(shù)的反應(yīng)條件 DNA或 RNA模板 5‘ 5‘ 待擴(kuò)增 DNA區(qū)域 5‘ 94℃ 5 min 5‘ 5‘ 55℃ 退火 5‘ 5‘ 聚合 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 循環(huán) 2530次 目標(biāo) DNA片段達(dá) 106107 變性 70℃ DNA引物 DNA聚合酶 dNTPs Mg2+（ 緩沖液） PCR反應(yīng)的質(zhì)量指標(biāo) PCR反應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有： 特異性（序列選擇） 有效性（序列產(chǎn)量） 上述三大標(biāo)準(zhǔn)并非由單一因素所決定，因此在 PCR反應(yīng)中必須 準(zhǔn)確性（序列對(duì)錯(cuò)） 對(duì)多種參數(shù)進(jìn)行聯(lián)合控制和改進(jìn)，但由于 PCR反應(yīng)中的各參數(shù)往往 是相互影響的，因此任何參數(shù)的改進(jìn)不可能同時(shí)滿足特異性、有效 性、準(zhǔn)確性。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的精確性 2 PCR的 DNA聚合酶與擴(kuò)增的精確性 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 DNA聚合酶對(duì) PCR精確性的重要影響 DNA聚合酶的使用 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的精確性 利用 PCR技術(shù)擴(kuò)增 DNA靶序列的一個(gè)重要問題是這種 DNA體外聚 合反應(yīng)的序列忠實(shí)程度，即 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物序列的 準(zhǔn)確率 。 PCR反應(yīng)的 準(zhǔn)確率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)胞內(nèi)的 DNA聚合反應(yīng)，除了缺少完善的 DNA聚合校 正系統(tǒng)外，影響 PCR反應(yīng) 準(zhǔn)確率的因素還包括： DNA聚合酶的保真性能（主要因素） DNA鏈的物理損傷 PCR反應(yīng)體系的潔凈度 DNA聚合酶對(duì) PCR精確性的重要影響 DNA聚合酶的保真性主要取決于其 3’ →5 ’ 的核酸外切酶活性，它 負(fù)責(zé)對(duì)錯(cuò)誤摻入的堿基進(jìn)行校正。相關(guān)研究結(jié)果表明， DNA聚合酶的 出錯(cuò)率在每輪延伸每核苷酸 X 10–6 X 10–4范圍內(nèi)。 DNA聚合 酶的堿基摻入錯(cuò)誤可能發(fā)生在其延伸階段的五種活性： 與 dNTP的結(jié)合特異性 磷酸二酯鍵的形成速率 焦磷酸的釋放速率 堿基錯(cuò)誤摻入之后的持續(xù)延伸性 3’ →5 ’ 的核酸外切活性的強(qiáng)弱 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Taq DNA酶的聚合出錯(cuò)率較高（ ），因?yàn)樗鼪]有 3’ →5 ’的 的核酸外切酶活性和校正功能。然而通過優(yōu)化反應(yīng)條件，可使 Taq酶的 聚合出錯(cuò)率降低到原來的 1/3。 Taq DNA聚合 酶催化的聚合反應(yīng)的普遍 則 Taq DNA酶還常常導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的缺失突變。 Taq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） 錯(cuò)誤類型是由 AT轉(zhuǎn)換為 GC； 如果模板 DNA具有形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性 避免稀釋保存 Taq DNA聚合 酶 Taq DNA聚合 酶在室溫下也具有延伸引物的活性 Taq DNA酶在使用時(shí)應(yīng)注意： 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 KlenTaq DNA聚合酶 是一種 N端缺失了 的 Taq DNA聚合酶，因而 沒有 5’ 的核酸外切酶活性； KlenTaq DNA聚合酶 的 Mg2+最佳濃度范圍很寬，因此很容易優(yōu)化 KlenTaq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） 在最佳反應(yīng)條件下， KlenTaq DNA聚合酶 出錯(cuò)率為 X 10–5， 性能略優(yōu)于 Taq DNA聚合酶。 反應(yīng)條件； 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Tth DNA聚合酶在 Mn2+的存在下，能有效地反轉(zhuǎn)錄長度在 1000堿 基以下的 RNA； Tth DNA聚合酶在 Mg2+的存在下，能由 DNA模板合成 DNA；
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