聚合酶鏈反應及其應用-展示頁
2025-06-04 18:12本頁面
【正文】 5‘ 5‘ 引物 退火 5‘ 5‘ 底物 聚合 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 加熱 變性 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 退火 引物 底物 聚合 加熱 變性 引物 退火 底物 聚合 1 2 3 5‘ 5‘ 5‘ PCR技術(shù)的反應條件 DNA或 RNA模板 5‘ 5‘ 待擴增 DNA區(qū)域 5‘ 94℃ 5 min 5‘ 5‘ 55℃ 退火 5‘ 5‘ 聚合 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 循環(huán) 2530次 目標 DNA片段達 106107 變性 70℃ DNA引物 DNA聚合酶 dNTPs Mg2+（ 緩沖液） PCR反應的質(zhì)量指標 PCR反應的質(zhì)量標準有： 特異性（序列選擇） 有效性（序列產(chǎn)量） 上述三大標準并非由單一因素所決定，因此在 PCR反應中必須 準確性（序列對錯） 對多種參數(shù)進行聯(lián)合控制和改進，但由于 PCR反應中的各參數(shù)往往 是相互影響的，因此任何參數(shù)的改進不可能同時滿足特異性、有效 性、準確性。5 2 3 4 1 6 7 8 PCR的原理與反應條件 PCR的 DNA聚合酶與擴增的精確性 PCR的模板及制備 PCR的引物設計及合成 PCR反應的其它控制參數(shù) PCR技術(shù)的衍生與發(fā)展 PCR技術(shù)在生命科學研究中的應用 PCR技術(shù)在臨床醫(yī)學方面的應用 聚合酶鏈反應及其應用 PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 1 PCR的原理與反應條件 PCR技術(shù)的反應條件 PCR技術(shù)的基本原理 PCR反應的質(zhì)量指標 PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 聚合酶鏈反應 （ Polymerase Chain Reaction， PCR ） 又稱為 PCR 擴增技術(shù) ，是一種高效、快速、特異性的體外 DNA聚合程序。 1985年 ， 美國 PEcetus公司人類遺傳研究室的 Kary mullis發(fā)明了具有劃時代意義的 PCR技術(shù)； 1988年 ， 美國 PEcetus公司推出世界上第一臺 PCR熱循環(huán)儀，從而使 PCR反應自動化； 1993年 ， Kary mullis因發(fā)明 PCR技術(shù)獲得 諾貝 爾化學獎； 1995年 ， 定量 PCR儀誕生，使定量研究 DNA靶序列成為現(xiàn)實。 PCR擴增反應的精確性 2 PCR的 DNA聚合酶與擴增的精確性 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 DNA聚合酶對 PCR精確性的重要影響 DNA聚合酶的使用 PCR擴增反應的精確性 利用 PCR技術(shù)擴增 DNA靶序列的一個重要問題是這種 DNA體外聚 合反應的序列忠實程度，即 DNA擴增產(chǎn)物序列的 準確率 。相關(guān)研究結(jié)果表明， DNA聚合酶的 出錯率在每輪延伸每核苷酸 X 10–6 X 10–4范圍內(nèi)。然而通過優(yōu)化反應條件，可使 Taq酶的 聚合出錯率降低到原來的 1/3。 Taq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） 錯誤類型是由 AT轉(zhuǎn)換為 GC； 如果模板 DNA具有形成二級結(jié)構(gòu)的可能性 避免稀釋保存 Taq DNA聚合 酶 Taq DNA聚合 酶在室溫下也具有延伸引物的活性 Taq DNA酶在使用時應注意： 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 KlenTaq DNA聚合酶 是一種 N端缺失了 的 Taq DNA聚合酶，因而 沒有 5’ 的核酸外切酶活性； KlenTaq DNA聚合酶 的 Mg2+最佳濃度范圍很寬，因此很容易優(yōu)化 KlenTaq DNA聚合酶（ Thermus aquaticus） 在最佳反應條件下， KlenTaq DNA聚合酶 出錯率為 X 10–5， 性能略優(yōu)于 Taq DNA聚合酶。 Tth DNA聚合酶在較高的溫度下仍具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，因此 能很 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 Pfu是一種 高保真 的 DNA聚合酶，出錯率極低； Pfu DNA聚合酶擴增出的產(chǎn)物帶有平頭末端； Pfu DNA聚合酶擴增速度極快，達 2 min / kb； Pfu DNA聚合酶（ Pyrococcus furiosus） Pfu DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性很高。 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 DeepVent DNA聚合酶是一種在低溫和高溫條件下均極其穩(wěn)定的 聚合酶，且能使用廣范圍的輔助溶劑如甲酰胺和 DMSO等； DeepVent DNA聚合酶能產(chǎn)生長達 14 kb的擴增產(chǎn)物，其 外切酶 DeepVent DNA聚合酶（ Pyrococcus species GBD） 活性 比 Vent DNA聚合酶高 4 倍，聚合活性比 Taq DNA酶高 515倍， 度小于 2 kb時，擴增產(chǎn)物的長度與 Mg2+的濃度并無關(guān)聯(lián)； 如果擴增長度大于 2 kb， 則需要高于 2 mM的 Mg2+， 而在擴增長 如果模板鏈中存在次黃嘌呤核苷或脫氧尿嘧啶核苷， Vent DNA 聚合酶不能延伸引物。 UITma DNA聚合酶（ Thermotoga maritima） DNA聚合
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