聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用-wenkub.com
2025-05-23 18:12 本頁(yè)面
【正文】 PCR臨床診斷術(shù) PCR臨床疾病診斷術(shù)的主要原理有下列幾個(gè)方面： 檢測(cè)病變基因的缺失或缺損 （擴(kuò)增產(chǎn)物變小或無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物） 檢測(cè)病變基因的點(diǎn)突變 （擴(kuò)增產(chǎn)物電泳遷移率改變） 檢測(cè)病變基因的重排 （擴(kuò)增產(chǎn)物大小改變） 上述方法可以診斷包括各類(lèi)遺傳病、惡性腫瘤、免疫紊亂在內(nèi)的多 種疾病，但始終沒(méi)有獲得美國(guó) FDA的批準(zhǔn)，其主要原因是 PCR診斷術(shù)的 檢測(cè)染色體易位 （擴(kuò)增產(chǎn)物大小改變） 骨髓移植的 PCR指紋圖譜快速配型 （隨機(jī)引物擴(kuò)增） 檢測(cè)病變 mRNA的結(jié)構(gòu) （ 擴(kuò)增產(chǎn)物大小改變） 可靠性還受到置疑，有時(shí)使用不同的程序會(huì)產(chǎn)生兩種截然不同的結(jié)果。 染色體 DNA的引物原位雜交 通過(guò)熒光探針使染色體發(fā)光是細(xì)胞遺傳學(xué)的一種繪圖技術(shù)，涉及到 熒光原位雜交 （ FISH， Fluorescent In Situ Hybridization ）和 引物原位 雜交 （ PRINS， Primed In Situ hybridization ）程序，用于基因圖譜繪 制、染色體畸形展示、基因表達(dá)、基因組構(gòu)成、感染病定性、病毒整合 位點(diǎn)調(diào)查等方面。 錨定 PCR（ Anchored PCR） 反轉(zhuǎn)錄 AAAAA 3’ 5’ 3‘ GGGGGGGG TdT 錨定引物 錨定 PCR又稱(chēng)為 cDNA末端快速擴(kuò)增 PCR， 主要用于 5‘端序列未知的 cDNA的擴(kuò)增和克隆。 貝的特定 DNA序列。 不對(duì)稱(chēng) PCR（ Asymmetric PCR） 在 PCR擴(kuò)增循環(huán)中引入不同 的引物濃度，使得由兩條引物介 導(dǎo)擴(kuò)增反應(yīng)呈不對(duì)稱(chēng)狀態(tài)，這種 戰(zhàn)略稱(chēng)為 不對(duì)稱(chēng) PCR技術(shù)。 6 PCR技術(shù)的衍生與發(fā)展 LA PCR（ Long and Accurate PCR） RT PCR（ Reverse Transcriptase） 原位 PCR（ In Situ PCR） 定量 PCR（ Quantitative PCR） 錨定 PCR（ Anchored PCR） 多重 PCR（ Multi PCR） 反向 PCR（ Inverted PCR） 不對(duì)稱(chēng) PCR（ Asymmetric PCR） LA PCR（ Long and Accurate PCR） LA PCR是一種專(zhuān)門(mén)用于精確擴(kuò)增較長(zhǎng) DNA片段的特種 PCR程 序，其關(guān)鍵的技術(shù)是結(jié)合使用兩種熱穩(wěn)定的 DNA聚合酶，可以擴(kuò)增 出 5 40 kb的 DNA大片段。 有效性的改進(jìn)： 對(duì)于 1kb以上片段的擴(kuò)增，增加循環(huán)中各步驟的滯留時(shí)間。 延伸聚合溫度和時(shí)間 延伸聚合溫度和時(shí)間 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 72 ℃ 60 120 secs PCR擴(kuò)增反應(yīng)中普遍使用的 DNA聚合酶的聚合速度每秒至少 50 個(gè)堿基，所以如果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度小于 400 bp， 聚合時(shí)間可以少 于 15秒，特別是當(dāng)退火溫度選得較高的時(shí)候，在退火階段就有一些 單體摻入。 變性溫度和時(shí)間 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 92 96℃ 30 120 secs 退火雜交溫度和時(shí)間 退火溫度和時(shí)間 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 37 65℃ 10 120 secs 退火時(shí)，引物迅速雜交。 Mg+2的濃度影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、引物退 火、引物二聚體的形成、熔點(diǎn)溫度、酶的活性和準(zhǔn)確性。 也應(yīng)同步降低。在模 板量一定的情況下，降低引物濃度實(shí)際上也是降低引物與模板 的分子之比。 引物的在線設(shè)計(jì)工具及免費(fèi)軟件簡(jiǎn)介 Primers! /javascript/ Primers!是一種基于 Java的引物設(shè)計(jì)程序，可以選擇所期望的引物 長(zhǎng)度、最大 Tm值、最小 Tm值、誤配堿基對(duì)數(shù)等四種參數(shù)輸入引物序列 其特殊的優(yōu)點(diǎn)是能限定所輸入的序列中適合引物設(shè)計(jì)的區(qū)域，這對(duì)檢索 若干 kb長(zhǎng)的 DNA片段中各種可能的引物是很有利的。 至少應(yīng)有 12個(gè)堿基必須是特異性的。 PCR引物的設(shè)計(jì)原則 引物與模板的互補(bǔ)程度 在一般情況下，并不要求引物與模板的序列達(dá)到 100%互補(bǔ)，但 檢查靶序列上其它可能存在的引物同源區(qū)域 為了減少 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染本底，在設(shè)計(jì)引物序列時(shí)應(yīng)檢查模 板 DNA上是否存在潛在的引物同源區(qū)域。 PCR引物的設(shè)計(jì)原則 退火溫度（ Ta） 引物的退火溫度一般要比估計(jì)的相應(yīng)熔點(diǎn)溫度低 5℃ 左右，在很多 情況下，兩條引物的退火溫度不盡相同，只要兩者相差不到 46℃ ， 尚 不至于影響 RCR擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)量，但它們的退火溫度應(yīng)在 5575℃ 范圍 引物堿基 ≤20， Ta = 4 X（ G+C） + 2 X（ A+T） 5（ ℃ ） 內(nèi)。 PCR模板制備與純化 從各種粗樣品中去除 PCR反應(yīng)抑制劑的程序不盡相同，但常用的 手段包括： 樣品稀釋 溶劑萃?。?氯仿 ﹕ 異戊基乙醇 49﹕1 ） 乙醇沉淀 高速離心 超濾 粗樣品中的 PCR抑制劑 糞便 膽鹽、膽紅素（抑制濃度 50mg / mL） 血液 亞鐵血紅素、聚乙醇磺酸鈉、 heparin（ 抗凝劑） 土壤 腐殖物質(zhì)、含鐵化合物 植物 硫酸右旋糖苷 食品 未鑒定的抑制劑 痰液 未鑒定的抑制劑 PCR模板的使用 PCR模板 的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍： 102 105 拷貝 特異性的改進(jìn)： 增加模板 DNA的量、降低引物與模板的分子比 有效性的改進(jìn)： 增加引物與模板的分子比 模板濃度的變化很大程度上取決于待擴(kuò)增的堿基序列，但一般 而言，模板 DNA長(zhǎng)度小，
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