實驗二-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、酶切鑒定-全文預(yù)覽
【正文】 遷移率有影響，如共價閉環(huán)DNA＞直線DNA＞開環(huán)雙鏈DNA。第三節(jié) 瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)目的：掌握瓊脂糖凝膠電泳基本操作原理：酶存在“星號”活性或其它內(nèi)切酶污染使底物產(chǎn)生非特異切割。4．RFLP酶解片段在電泳分離的過程中，要根據(jù)片段的大小選擇不同的瓊脂糖濃度，如果產(chǎn)生的片段大部分小于500bp以下，可選用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。注意事項：1．PCR引物設(shè)計時，盡量選擇基因兩側(cè)的保守區(qū)，在PCR擴增時，注意Mg2+對Taq酶活性的影響。（2）限制性核酸內(nèi)切酶BsmAI（10u/ul）（3）100bp DNA ladder（4） % 瓊脂糖凝膠（5）TAE緩沖液操作步驟：1．在Eppendorf管中依次加入 μl 雙蒸水 1μl 10酶切緩沖液 5μl DNA BsmAI（10u/μl）2．將裝有上述反應(yīng)液的Eppendorf管于37℃水浴保溫1小時。...G T C T C (N)...339。加熱滅活DNase I或核酸內(nèi)切酶，再加入Taq DNA聚合酶和模板做PCR。2）污染源的處理①稀酸或84′消毒液處理法：用1 mol/L HCl或適量84′消毒液處理污染源，使殘存的DNA脫嘌呤降解。其原理是：在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中以 dUTP取代dTTP，使擴增產(chǎn)物中含有尿嘧啶。⑥操作者帶手套操作，且應(yīng)勤換手套。②耐高壓的試劑及器材應(yīng)高壓滅菌，但酶、引物、dNTP、加樣器等不能高壓滅菌，以免試劑失活或器材損壞。除此之外，選擇特征性強的序列來進行引物設(shè)計，使用純度較高的引物、酶、Mg2+ 、模板DNA都是有效的方法，必要時還可以使用提高特異性的添加劑。為了監(jiān)控PCR實驗的污染情況，應(yīng)該同時設(shè)立陰性對照，重復(fù)試驗，甚至對PCR產(chǎn)物進行測序分析，以鑒定擴增片段的正確性。若自己配制試劑，配好后必需高壓滅菌。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系各成分名稱反應(yīng)體系各成分濃度各成分體積（181。試劑：（1）TaKaRa Taq (5U/ ml)（2）10PCR緩沖液(Mg2+ Plus)（3）dNTP混合液(each 10mM)（4）DNA模板 (1
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